ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

すべての実験手順は、マルメ/ルンド動物研究倫理委員会(倫理許可番号12548-19)によって承認され、スウェーデン動物福祉庁の規則および動物実験に関するEU指令2010/63 / EUに同意して実施されました。本研究では、C57BL6 / Jおよび コンタクチン関連タンパク質様 2(Cntnap2)ノックアウト(KO)マウスを、オスとメスの両方で、生後(P)2に使用しました。ヒト胚性幹細胞(hESC)を使用した。動物および幹細胞は市販の供給源から入手した( 材料表を参照)。 1. hdIN前駆体の生成 注:このセクションのすべての手順は、細胞培養フードで行われます。hESCは、幹細胞培養培地を使用してコーティングされたプレート上でフィーダーフリー細胞として維持され、コロニーとして継代されました。 hESCからhdIN前駆体へのフォワードプログラミングを実行します(図1)。注: フォワードプログラミングアプローチは、Gonzalez-Ramos et al.8 および Yang et al.9 で説明されている手順に基づいています。10 μMのROCK阻害剤(RI)を含む新鮮な幹細胞培養培地中で、Tet-Onシステムを含むレンチウイルスベクターでhESCを形質導入します( 材料の表を参照)。インキュベーター内で37°Cに保ちます。 形質導入の16時間後に培地を新鮮な幹細胞培養培地に変更し、形質導入されていないhESCと同様に形質導入細胞を維持します。 コンフルエントになったら、細胞剥離溶液(材料の表を参照)を使用してhESCを単一細胞として分離し、in vitro(DIV)-1日に10 μMのRIを含む幹細胞培養培地中で、3 x 105細胞/ウェルの密度でコーティングされた6ウェルプレートにプレートします。 1 DIVで、培養培地を2 g/Lのドキシサイクリンを含むN2培地に交換します(DOX、 材料表を参照)。注:DOXは、Ascl1およびDlx29の導入遺伝子発現を1DIVから7DIVに誘導するために使用され、その後、飲料水25に添加することによってin vivoで継続します。 2 DIVで、抗生物質耐性の選択期間が始まり、5 DIVまで続きます。 ピューロマイシン(ピューロ)とハイグロマイシン(ハイグロ)を新鮮な培地に追加します( 材料の表を参照)。2 DIV、4 DIV、および 5 DIV のメディアを変更します。注:形質導入および非形質導入hESCを使用して分化プロトコルの前にピューロと湿度の濃度を最適化し、抗生物質耐性カセットを運ぶ細胞のみの生存を確保します。このプロトコルでは、0.5 μg/mLのピューロと750 μg/mLのハイグロを使用しました。 5 DIVで、抗生物質選択期間は終了します。2 g/LのDOXと4 μMのシトシンβ-D-アラビノフラノシドを添加したN2培地に変更してください(Ara-C、 材料表を参照)。 図1:Ascl1およびDlx2の過剰発現によるhESCからのhdIN前駆体の生成。(A)hdIN前駆体の生成に用いた分化プロトコルの概略図。(B-E)(B)ニューロンマーカーMAP2、(C)増殖マーカーKi67、(D)一般的な核染色、および(E)以前のマーカーのマージについての7DIVでのhdIN前駆体の免疫細胞化学。スケールバー:50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2. 移植用単一細胞懸濁液の調製 注:このセクションのすべての手順は、細胞培養フードで行われます。7 DIVでは、hdIN前駆体が解離し、移植に使用されます。 以下の手順に従ってセルの剥離を実行します。培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで細胞を注意深くすすぎます。 400 μLの細胞剥離溶液( 材料の表を参照)を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。注意: ソリューションによる表面全体のカバレッジを確保します。 インキュベーター内で37°Cで2〜3分間インキュベートし、細胞の境界が光沢のあるように見え始め、細胞表面タンパク質の酵素分解とウェル表面からの剥離を示します。注意: 細胞の生存率を高めるために、すべての細胞が完全に剥離して浮遊しているときにあまり長く待たないでください。 次いで、6ウェルプレートの各ウェルに600μLの新鮮なN2培地を加えて酵素を停止し、ピペットで機械的に、細胞を剥離させ、単一細胞懸濁液を得るのを助けた。 細胞懸濁液をプラスチックチューブ(15 mL)に移し、室温(RT)で180 x g で4分間遠心分離します。 細胞の再懸濁を行う。真空システムを使用して上清を廃棄し(ペレットを乱さずに慎重に)、10 μMのRI、1 μg/mLのDNase、および2 μg/μLのDOXを含む移植培地にペレットを再懸濁します。 計数チャンバーと手動セルカウンターを使用して懸濁液中の全細胞をカウントし、容量を最終濃度100,000細胞/μLに調整します。 細胞懸濁液を、移植まで氷上の密閉チューブに最大4時間保持する。注:移植は、細胞懸濁液(7 DIV)の調製と同じ日に行わなければなりません。 3.海馬内細胞移植 注:このセクションのすべての手順は、動物施設の細胞培養フードの外で実行されます。出生後の早期脳内への細胞移植は、P0を生年月日を考慮してP2で行った。 以下の手順で移植実験の準備をしてください。すべての外科用材料をオートクレーブするか、不可能な場合は、別の承認された方法で滅菌します。 注入シリンジをガラス毛細管なしでホルダーに取り付けます。針を水ですすいでください。注意: 針は33Gでなければなりません。 30Gのインスリン針の先端を90°カーブさせます。 子犬を頭を平らにして配置するための自家製のPlay-Dohのようなステージを作成します(図2A)。 新しい環境に順応できるように、手術のために何かを準備する前に、母親と子犬と一緒にマウスケージをフェッチします。 湿った氷の入ったトレイと、イソフルラン用の紙を入れた空のケージを用意します。 マウスの子犬を麻酔します。一枚の紙にイソフルランを浸し( 材料の表を参照)、空のケージの中に置きます。慎重に1匹の子犬を取り、イソフルランに浸した紙でケージに入れます。注:3匹未満の子犬をお母さんと一緒に残さないでください。イソフルラン麻酔の20〜30秒を超えないでください、さもなければ子犬は死ぬかもしれません。 運動停止による麻酔の効果を確認します。 麻酔後すぐに、湿った氷の表面の濡れたティッシュの上に子犬を置きます。上肢が白みを帯びるまで、動物を氷上に3分間置きます(図2B、青い矢印)。これには通常2〜3分かかります。 この時間を使用して、シリンジに細胞懸濁液を装填します。前にピペットで慎重に細胞を再懸濁してください。 子犬を定位固定装置フレームに置きます。イヤーバーを反対方向に使用します(図2A、マゼンタの矢印)。注意: イヤーバーの裏側はそれほど尖っておらず、P2の子犬には耳がないため、動物を傷つけないように平らな側を使用してください。 横から、頭がまっすぐかどうかを確認します。頭は平らでなければなりません。Play-Dohのようなステージを使用して調整します。注:この年齢の子犬はまだ目を開いていないので、この点に関して追加の手順を実行する必要はありません。子犬はこの年齢で毛皮を持っていないので、その領域の剃毛は必要ありません。皮膚への開放切開ではなく、縫合も行われないため、特定の痛みの治療は行われません。 手術の全期間中、子犬を氷の上(ティッシュペーパーの上)に覆ったままにします。注意: 氷を子犬の皮膚に直接接触させないでください。 注射を行います。エタノールに浸した軟組織を使用して皮膚の表面をきれいにします。 ラムダを識別し、定位固定装置のデジタルディスプレイコンソールで座標をゼロに設定します(図2C、黄色の破線)。矢状縫合糸とラムドイド縫合糸は、血管新生しているため、赤い線として目で簡単に見えます。注意: ラムダの視覚化に問題がある場合は、小さな氷片を皮膚に置き、冷えるまで数分待ちます。次に、氷片を取り除くと、肌の微妙な白化により視覚化できます。 注射針を目的の座標に移動します。記載されたプロトコルでは、標的領域は海馬であり、座標は次の通りであった:前後(AP)+0.85および中外側(ML)+1.35。 90°曲がったインスリン針を使用して頭蓋骨を貫通し、小さな穴を開けます。 頭蓋骨を横切るまで注射針を下ろし、背腹(DV)座標をゼロにします。目的のDV座標になるまで針を下げます。記載されたプロトコルでは、座標はDV −1.1であった。 所定の時間間隔に従って注入する。注:説明されているプロトコルでは、正確なタイミングは次のとおりでした:(i)DV座標に下がった後、3分間待ちます、(ii)1μLのボリュームを5分間注入し、(iii)すべてのボリュームが注入された後、3分間待ちます。 針をゆっくりと引っ込めます。 手順を終了します。注:子犬の生存を確保し、低体温による麻酔に起因する損傷を避けるために、手術は15分以上続くことはできません。子犬が動き始めるまで手で温めてから、母親に返します。 0.5%ショ糖溶液に1mg/mLの濃度のDOXを飲料水として、移植前2日以上、3週間以上投与し、 生体内での細胞分化を継続します。 図2:P2の新生マウス仔における定位固定術移植。 (A)子犬の体を所定の位置に保持し、逆さまのイヤーバー(マゼンタの矢印)を行うためのPlay-Dohのようなステージ。(B)白い前足(青い矢印)は、子犬が低体温症によって麻酔を受けているように、その領域の血流が減少していることを示します。(C)柔らかいティッシュペーパーの上に子犬がすでに氷で覆われているセットアップの概要。(C#)注射針がすでに脳に挿入された状態で、子犬の頭のクローズドズーム(ラムダとラムドイドの縫合を示す黄色の破線)。この図はゴンザレス・ラモスらから改作されています。27. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。