Separación de subpoblaciones de células inmunitarias en muestras de sangre periférica de niños con mononucleosis infecciosa
Summary
Describimos un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia para aislar y analizar subpoblaciones de células inmunes definidas de células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células asesinas naturales). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden ser purificadas y analizadas.
Abstract
La mononucleosis infecciosa (IM) es un síndrome agudo asociado principalmente con la infección primaria por el virus de Epstein-Barr (VEB). Los principales síntomas clínicos incluyen fiebre irregular, linfadenopatía y aumento significativo de linfocitos en sangre periférica. El mecanismo patogénico de la MI aún no está claro; No existe un método de tratamiento eficaz para ello, con terapias principalmente sintomáticas disponibles. La pregunta principal en la inmunobiología del VEB es por qué solo un pequeño subconjunto de individuos infectados muestra síntomas clínicos graves e incluso desarrolla neoplasias malignas asociadas al VEB, mientras que la mayoría de los individuos son asintomáticos de por vida con el virus.
Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos innatos citotóxicos que son importantes para matar las células infectadas por el VEB. La proporción de células T CD4 + disminuye, mientras que la de células T CD8 + se expande dramáticamente durante la infección aguda por VEB, y la persistencia de las células T CD8 + es importante para el control de por vida de la IM. Esas células inmunes juegan un papel importante en la IM, y sus funciones deben identificarse por separado. Para este propósito, los monocitos se separan primero de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos IM utilizando microperlas CD14, una columna y un separador magnético.
Los PBMC restantes se tiñen con peridina-clorofila-proteína (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, anticuerpos APC anti-CD56 y anticuerpos APC anti-CD16 para clasificar las células T CD4+, las células T CD8+, las células B y las células NK utilizando un citómetro de flujo. Además, se realizó la secuenciación del transcriptoma de cinco subpoblaciones para explorar sus funciones y mecanismos patogénicos en IM.
Introduction
El virus de Epstein-Barr (VEB), un γ-herpesvirus también conocido como virus del herpes humano tipo 4, es ubicuo en la población humana y establece una infección latente de por vida en más del 90% de la población adulta1. La mayoría de las infecciones primarias por VEB ocurren durante la infancia y la adolescencia, con una fracción de pacientes que se manifiestan con mononucleosis infecciosa (IM)2, mostrando inmunopatología característica, incluida una respuesta inmune activada con células T CD8 + en sangre y una proliferación transitoria de células B infectadas por VEB en la orofaringe3. El curso de la IM puede durar de 2 a 6 semanas y la mayoría de los pacientes se recuperan bien4. Sin embargo, algunos individuos desarrollan síntomas persistentes o recurrentes similares a los IM con alta morbilidad y mortalidad, que se clasifica como infección crónica activa por VEB (VEB)5. Además, el VEB es un virus oncogénico importante, que está estrechamente relacionado con una variedad de neoplasias malignas, incluidas las neoplasias epitelioides y linfoides como el carcinoma nasofaríngeo, el linfoma de Burkitt, el linfoma de Hodgkin (LH) y el linfoma de células T/NK6. Aunque el VEB se ha estudiado durante más de 50 años, su patogénesis y el mecanismo por el cual induce la proliferación de linfocitos no se han dilucidado completamente.
Varios estudios han investigado las firmas moleculares para la inmunopatología de la infección por VEB mediante secuenciación del transcriptoma. Zhong et al. analizaron el perfil del transcriptoma completo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de niños chinos con IM o CAEBV para encontrar que la expansión de las células T CD8 + se encontró predominantemente en el grupo IM7, lo que sugiere que las células T CD8 + pueden desempeñar un papel importante en la IM. Del mismo modo, otro estudio encontró menores proporciones de células T y CD19+ B citotóxicas específicas del VEB y mayores porcentajes de linfocitos T CD8+ en pacientes con MI causada por infección primaria por VEB que en pacientes con MI causada tanto por reactivación del VEB como por otros agentes8. Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Al Tabaa et al. encontraron que las células B se activaron policlonalmente y se diferenciaron en plasmablastos (CD19+, CD27+ y CD20−, y células CD138−) y células plasmáticas (CD19+, CD27+ y CD20−, y CD138+) durante IM9. Además, Zhong et al. encontraron que los marcadores de monocitos CD14 y CD64 estaban regulados al alza en CAEBV, lo que sugiere que los monocitos pueden desempeñar un papel importante en la respuesta inmune celular de CAEBV a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis hiperactiva7. Alka et al. caracterizaron el transcriptoma de células NK CD56dim CD16+ clasificadas por MACS de cuatro pacientes de IM o HL y encontraron que las células NK de IM y HL tenían inmunidad innata regulada a la baja y genes de señalización de quimiocinas, que podrían ser responsables de la hiporeactividad de las células NK10. Además, Greenough et al. analizaron la expresión génica de células T CD8 + clasificadas de 10 PBMC de individuos con IM. Informaron que una gran proporción de células T CD8 + en IM eran específicas del virus, activadas, en división y preparadas para ejercer actividades efectoras11. Tanto las respuestas mediadas por células T, específicas del VEB, como las respuestas no específicas mediadas por células NK desempeñan funciones esenciales durante la infección primaria por VEB. Sin embargo, estos estudios solo investigaron los resultados del transcriptoma de la mezcla diversa de células inmunes o solo una cierta subpoblación de linfocitos, lo que no es suficiente para la comparación exhaustiva de las características moleculares y funciones de diferentes subpoblaciones de células inmunes en niños con MI en el mismo estado de enfermedad.
Este documento describe un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar y analizar subpoblaciones definidas de células inmunes de PBMC (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células NK). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden purificarse usando un separador magnético y FACS o analizarse por citometría de flujo. El ARN se puede extraer de las células purificadas para la secuenciación del transcriptoma. Este método permitirá la caracterización y expresión génica de diferentes células inmunes en los mismos estados de enfermedad de individuos con MI, lo que ampliará nuestra comprensión de la inmunopatología de la infección por VEB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo representa una forma eficiente de clasificar las subpoblaciones de células inmunes de sangre periférica. En este estudio, se seleccionaron muestras de sangre venosa de pacientes con MI, portadores sanos del VEB y niños no infectados por el VEB como objetivo de la investigación. Este trabajo utilizando la sangre periférica de pacientes de IM se centra principalmente en analizar y determinar las proporciones de diferentes subconjuntos celulares a través de la citometría de flujo multicolor. La secuenc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7222059) y el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
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