Summary

Scheiding van immuuncelsubpopulaties in perifere bloedmonsters van kinderen met infectieuze mononucleosis

Published: September 07, 2022
doi:

Summary

We beschrijven een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van perifere mononucleaire bloedcellen (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en natural killer-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd en geanalyseerd.

Abstract

Infectieuze mononucleosis (IM) is een acuut syndroom dat meestal wordt geassocieerd met primaire Epstein-Barr-virus (EBV) -infectie. De belangrijkste klinische symptomen zijn onregelmatige koorts, lymfadenopathie en significant verhoogde lymfocyten in perifeer bloed. Het pathogene mechanisme van IM is nog onduidelijk; er is geen effectieve behandelmethode voor, waarbij voornamelijk symptomatische therapieën beschikbaar zijn. De belangrijkste vraag in EBV-immunobiologie is waarom slechts een kleine subgroep van geïnfecteerde personen ernstige klinische symptomen vertoont en zelfs EBV-geassocieerde maligniteiten ontwikkelt, terwijl de meeste personen asymptomatisch zijn voor het leven met het virus.

B-cellen zijn voor het eerst betrokken bij IM omdat EBV-receptoren op hun oppervlak worden gepresenteerd. Natural killer (NK) cellen zijn cytotoxische aangeboren lymfocyten die belangrijk zijn voor het doden van EBV-geïnfecteerde cellen. Het aandeel CD4+ T-cellen neemt af, terwijl dat van CD8+ T-cellen dramatisch uitbreidt tijdens acute EBV-infectie, en de persistentie van CD8+ T-cellen is belangrijk voor levenslange controle van IM. Die immuuncellen spelen een belangrijke rol in IM en hun functies moeten afzonderlijk worden geïdentificeerd. Voor dit doel worden monocyten eerst gescheiden van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) van IM-individuen met behulp van CD14-microbeads, een kolom en een magnetische separator.

De resterende PBMC’s zijn gekleurd met peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP)/Cyanine 5,5 anti-CD3, allophycocyanine (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 en APC anti-CD16 antilichamen om CD4+ T cellen, CD8+ T cellen, B cellen en NK cellen te sorteren met behulp van een flow cytometer. Bovendien werd transcriptoomsequencing van vijf subpopulaties uitgevoerd om hun functies en pathogene mechanismen in IM te onderzoeken.

Introduction

Epstein-Barr-virus (EBV), een γ-herpesvirus ook bekend als humaan herpesvirus type 4, is alomtegenwoordig in de menselijke bevolking en vestigt levenslange latente infectie bij meer dan 90% van de volwassen bevolking1. De meeste PRIMAIRE EBV-infecties treden op tijdens de kindertijd en adolescentie, waarbij een fractie van de patiënten zich manifesteert met infectieuze mononucleosis (IM)2, met karakteristieke immunopathologie, waaronder een geactiveerde immuunrespons met CD8+ T-cellen in het bloed en een voorbijgaande proliferatie van EBV-geïnfecteerde B-cellen in de orofarynx3. Het verloop van IM kan 2-6 weken duren en de meerderheid van de patiënten herstelt goed4. Sommige personen ontwikkelen echter aanhoudende of terugkerende IM-achtige symptomen met een hoge morbiditeit en mortaliteit, die is geclassificeerd als chronische actieve EBV-infectie (CAEBV)5. Bovendien is EBV een belangrijk oncogene virus, dat nauw verwant is aan een verscheidenheid aan maligniteiten, waaronder epithelioïde en lymfoïde maligniteiten zoalsnasofaryngeaal carcinoom, Burkitt-lymfoom, Hodgkin-lymfoom (HL) en T / NK-cellymfoom6. Hoewel EBV al meer dan 50 jaar wordt bestudeerd, zijn de pathogenese en het mechanisme waarmee het de proliferatie van lymfocyten induceert, niet volledig opgehelderd.

Verschillende studies hebben de moleculaire handtekeningen voor de immunopathologie van EBV-infectie onderzocht door transcriptoomsequencing. Zhong et al. analyseerden volledige transcriptoomprofilering van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) van Chinese kinderen met IM of CAEBV om te ontdekken dat CD8 + T-celexpansie voornamelijk werd gevonden in de IM-groep7, wat suggereert dat CD8 + T-cellen een belangrijke rol kunnen spelen bij IM. Evenzo vond een andere studie lagere percentages EBV-specifieke cytotoxische T- en CD19 + B-cellen en hogere percentages CD8 + T-cellen bij patiënten met IM veroorzaakt door primaire EBV-infectie dan bij patiënten met IM veroorzaakt door zowel EBV-reactivatie als andere middelen8. B-cellen zijn voor het eerst betrokken bij IM omdat EBV-receptoren op hun oppervlak worden gepresenteerd. Al Tabaa et al. vonden dat B-cellen polyclonaal geactiveerd en gedifferentieerd waren inplasmablasten (CD19+, CD27+ en CD20−, en CD138 cellen) en plasmacellen (CD19+, CD27+ en CD20, en CD138+) tijdens IM9. Bovendien vonden Zhong et al. dat monocytmarkers CD14 en CD64 werden geupreguleerd in CAEBV, wat suggereert dat monocyten een belangrijke rol kunnen spelen in de cellulaire immuunrespons van CAEBV via antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) en hyperactieve fagocytose7. Alka et al. karakteriseerden het transcriptoom van MACS gesorteerde CD56dim CD16+ NK cellen van vier patiënten van IM of HL en vonden dat NK-cellen van zowel IM als HL gedownreguleerde aangeboren immuniteit en chemokine signaleringsgenen hadden, die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de hyporesponsiviteit van NK-cellen10. Daarnaast analyseerden Greenough et al. genexpressie van gesorteerde CD8 + T-cellen van 10 PBMC’s van personen met IM. Ze meldden dat een groot deel van de CD8 + T-cellen in IM virusspecifiek, geactiveerd, delend en klaargestoomd waren om effectoractiviteiten uit te oefenen11. Zowel T-cel-gemedieerde, EBV-specifieke responsen als NK-cel-gemedieerde, niet-specifieke responsen spelen essentiële rollen tijdens primaire EBV-infectie. Deze studies onderzochten echter alleen de transcriptoomresultaten van het diverse mengsel van immuuncellen of alleen een bepaalde subpopulatie van lymfocyten, wat niet voldoende is voor de uitgebreide vergelijking van de moleculaire kenmerken en functies van verschillende immuuncelsubpopulaties bij kinderen met IM in dezelfde ziektetoestand.

Dit artikel beschrijft een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van PBMC’s (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en NK-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd met behulp van een magnetische separator en FACS of worden geanalyseerd door flowcytometrie. RNA kan uit de gezuiverde cellen worden geëxtraheerd voor transcriptoomsequencing. Deze methode zal de karakterisering en genexpressie van verschillende immuuncellen in dezelfde ziektetoestanden van personen met IM mogelijk maken, wat ons begrip van de immunopathologie van EBV-infectie zal vergroten.

Protocol

Bloedmonsters werden verkregen van patiënten met IM (n = 3), gezonde EBV-dragers (n = 3) en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen (n = 3). Vrijwilligers werden gerekruteerd uit het Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, en alle studies werden ethisch goedgekeurd. Ethische goedkeuring werd verkregen door de ethische commissie van het Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University (goedkeuringsnummer: [2021]-E-056-Y). Er werd afgezien van geïnformeerde toestemming van patiënten, omdat de studie all…

Representative Results

Referentie van de gatingstrategieDe gatingstrategie die wordt gebruikt om de vier lymfocytensubpopulaties te sorteren, is weergegeven in figuur 1. Kortom, lymfocyten worden geselecteerd (P1) op een dot plot die de granulositeit (SSC-A) versus grootte (FSC-A) weergeeft. Vervolgens worden afzonderlijke cellen geselecteerd (P2) op een dot plot met de grootte (FSC-A) versus forward scatter (FSC-H), terwijl doubletcellen worden uitgesloten. CD3+ T-cellen (P3) en CD…

Discussion

Dit protocol is een efficiënte manier om subpopulaties van perifere immuuncellen in het bloed te sorteren. In deze studie werden veneuze bloedmonsters van patiënten met IM, gezonde EBV-dragers en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen geselecteerd als onderzoeksdoelstelling. Dit werk met behulp van het perifere bloed van patiënten met IM richt zich voornamelijk op het analyseren en bepalen van de verhoudingen van verschillende celsubsets door middel van meerkleurige flowcytometrie. Transcriptoomsequencing wordt voornamelijk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) en het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Materials

APC anti-human CD16 Biolegend 302012 Fluorescent antibody 
APC anti-human CD56 (NCAM) Biolegend 362504 Fluorescent antibody 
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Biolegend 344616 Fluorescent antibody 
Automated cell counter BIO RAD TC20 Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) Becton, Dickinson and Company 644832 Cell sort
CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201 microbeads
Cell ctng slides BIO RAD 1450016 Cell count
Centrifuge tubes Falcon 35209715 15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium) Beyotime ST1303 EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes Becton, Dickinson and Company  367862  EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19 Biolegend 302206 Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000-044 Fetal Bovine Serum
 High-speed centrifuge Sigma  3K15 Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
 High-speed centrifuge Eppendorf 5424R Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium Dakewe DKW-KLSH-0100 Ficoll-Paque
LS Separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Separation columns
Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnetic bead separator
PE anti-human CD8 Biolegend 344706 Fluorescent antibody 
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 Biolegend 344808 Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS) BI 02-024-1ACS PBS
Polystyrene round bottom tubes Falcon 352235 5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent Ambion 15596024 Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit Beyotime C0011 Trypan Blue Staining

References

  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, L., Liu, M., Zhang, M., Ai, J., Tian, J., Wang, R., Xie, Z. Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis. J. Vis. Exp. (187), e64212, doi:10.3791/64212 (2022).

View Video