Summary

Отделение субпопуляций иммунных клеток в образцах периферической крови у детей с инфекционным мононуклеозом

Published: September 07, 2022
doi:

Summary

Описан метод, сочетающий иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток мононуклеарных клеток периферической крови (моноцитов, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и естественных клеток-киллеров). С помощью этого метода магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены и проанализированы.

Abstract

Инфекционный мононуклеоз (IM) является острым синдромом, в основном связанным с первичной инфекцией вируса Эпштейна-Барра (EBV). Основные клинические симптомы включают нерегулярную лихорадку, лимфаденопатию и значительное повышение лимфоцитов в периферической крови. Патогенный механизм ИМ до сих пор неясен; для него не существует эффективного метода лечения, в основном доступна симптоматическая терапия. Основной вопрос в иммунобиологии ВЭБ заключается в том, почему только у небольшой подгруппы инфицированных людей проявляются тяжелые клинические симптомы и даже развиваются злокачественные новообразования, связанные с ВЭБ, в то время как большинство людей бессимптомны на всю жизнь с вирусом.

В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Естественные клетки-киллеры (NK) являются цитотоксическими врожденными лимфоцитами, которые важны для уничтожения клеток, инфицированных EBV. Доля CD4 + Т-клеток уменьшается, в то время как доля CD8 + Т-клеток резко расширяется во время острой инфекции EBV, и персистенция CD8 + Т-клеток важна для пожизненного контроля IM. Эти иммунные клетки играют важную роль в IM, и их функции должны быть идентифицированы отдельно. Для этого моноциты отделяют сначала от мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) им-особей с помощью микрошариков CD14, колонки и магнитного сепаратора.

Остальные PBMCs окрашивают перидинин-хлорофилл-белком (PerCP)/цианином 5.5 анти-CD3, аллофикоцианином (APC)/цианином 7 анти-CD4, фикоэритрином (PE) анти-CD8, флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) анти-CD19, APC анти-CD56 и APC анти-CD16 антителами для сортировки CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и NK-клеток с использованием проточного цитометра. Кроме того, было проведено секвенирование транскриптома пяти субпопуляций для изучения их функций и патогенных механизмов в IM.

Introduction

Вирус Эпштейна-Барра (EBV), γ-герпесвирус, также известный как вирус герпеса человека типа 4, повсеместно распространен в человеческой популяции и устанавливает пожизненную латентную инфекцию у более чем 90% взрослого населения1. Большинство первичных инфекций ВЭБ происходит в детском и подростковом возрасте, причем у части пациентов проявляется инфекционный мононуклеоз (IM)2, демонстрируя характерную иммунопатологию, включая активированный иммунный ответ с CD8 + Т-клетками в крови и преходящую пролиферацию инфицированных ВЭБ В клеток в ротоглотке3. Курс ВМ может длиться 2–6 недель и большинство пациентов хорошо выздоравливают4. Тем не менее, у некоторых людей развиваются стойкие или рецидивирующие IM-подобные симптомы с высокой заболеваемостью и смертностью, которые классифицируются как хроническая активная инфекция ВЭБ (CAEBV)5. Кроме того, ВЭБ является важным онкогенным вирусом, который тесно связан с различными злокачественными новообразованиями, включая эпителиоидные и лимфоидные злокачественные новообразования, такие как аназофарингеальная карцинома, лимфома Беркитта, лимфома Ходжкина (HL) и Т/NK-клеточная лимфома6. Хотя ВЭБ изучается уже более 50 лет, его патогенез и механизм, с помощью которого он индуцирует пролиферацию лимфоцитов, не были полностью выяснены.

В нескольких исследованиях изучались молекулярные сигнатуры иммунопатологии ВЭБ-инфекции путем секвенирования транскриптома. Zhong et al. проанализировали профилирование цельного транскриптома мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) у китайских детей с IM или CAEBV, чтобы обнаружить, что cd8 + Т-клеточная экспансия была преимущественно обнаружена в группе IM7, предполагая, что CD8 + Т-клетки могут играть важную роль в IM. Аналогичным образом, другое исследование обнаружило более низкие пропорции специфичных для ВЭБ цитотоксических Т- и CD19+ В-клеток и более высокий процент CD8+ Т-клеток у пациентов с ВМ, вызванных первичной инфекцией ВЭБ, чем у пациентов с ВМ, вызванной как реактивацией ВЭБ, так и другими агентами8. В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Al Tabaa et al. обнаружили, что В-клетки были поликлонально активированными и дифференцированными интоплазмабластами (CD19+, CD27+ и CD20 и CD138 клетками) и плазматическими клетками (CD19+, CD27+ и CD20 и CD138+) во время IM9. Кроме того, Zhong et al. обнаружили, что моноцитарные маркеры CD14 и CD64 были повышены в CAEBV, предполагая, что моноциты могут играть важную роль в клеточном иммунном ответе CAEBV через антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и гиперактивный фагоцитоз7. Alka et al. охарактеризовали транскриптом MACS,отсортированных CD56dim CD16 + NK-клеток от четырех пациентов IM или HL и обнаружили, что NK-клетки как из IM, так и из HL имели сниженный врожденный иммунитет и сигнальные гены хемокина, которые могут быть ответственны за гипочувствительность NK-клеток10. Кроме того, Greenough et al. проанализировали экспрессию генов отсортированных CD8+ Т-клеток из 10 PBMCs людей с IM. Они сообщили, что большая часть CD8+ Т-клеток в IM была вирус-специфичной, активированной, делящейся и праймированной для оказания эффекторной активности11. Как Т-клеточно-опосредованные, специфические для ВЭБ ответы, так и NK-клеточные, неспецифические ответы играют важную роль во время первичной инфекции ВЭБ. Однако в этих исследованиях изучались только результаты транскриптома разнообразной смеси иммунных клеток или только определенной субпопуляции лимфоцитов, чего недостаточно для всестороннего сравнения молекулярных характеристик и функций различных субпопуляций иммунных клеток у детей с ВМ в одном и том же болезненном состоянии.

В данной статье описывается метод, который сочетает в себе иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS) для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток PBMCs (моноциты, CD4 + Т-клетки, CD8 + Т-клетки , В-клетки и NK-клетки). Используя этот метод, магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены с помощью магнитного сепаратора и FACS или проанализированы с помощью проточной цитометрии. РНК может быть извлечена из очищенных клеток для секвенирования транскриптома. Этот метод позволит характеризовать и экспрессию генов различных иммунных клеток в одних и тех же состояниях заболевания людей с IM, что расширит наше понимание иммунопатологии инфекции EBV.

Protocol

Образцы крови были получены у пациентов с ВМ (n = 3), здоровых носителей ВЭБ (n = 3) и детей, не инфицированных ВЭБ (n = 3). Добровольцы были набраны из Пекинской детской больницы, Столичного медицинского университета, и все исследования были этически одобрены. Этическое одобрение было получено …

Representative Results

Ссылка на стратегию гатингаСтратегия гатинга, используемая для сортировки четырех субпопуляций лимфоцитов, показана на рисунке 1. Вкратце, лимфоциты выбираются (P1) на точечном графике, показывающем гранулированность (SSC-A) по сравнению с размером (FSC-A). Затем в?…

Discussion

Этот протокол представляет собой эффективный способ сортировки субпопуляций иммунных клеток периферической крови. В этом исследовании образцы венозной крови пациентов с ВМ, здоровых носителей ВЭБ и детей, не инфицированных ВЭБ, были выбраны в качестве цели исследования. Эта работа с ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82002130), Пекинским фондом естественных наук (7222059) и Инновационным фондом медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-026).

Materials

APC anti-human CD16 Biolegend 302012 Fluorescent antibody 
APC anti-human CD56 (NCAM) Biolegend 362504 Fluorescent antibody 
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Biolegend 344616 Fluorescent antibody 
Automated cell counter BIO RAD TC20 Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) Becton, Dickinson and Company 644832 Cell sort
CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201 microbeads
Cell ctng slides BIO RAD 1450016 Cell count
Centrifuge tubes Falcon 35209715 15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium) Beyotime ST1303 EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes Becton, Dickinson and Company  367862  EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19 Biolegend 302206 Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000-044 Fetal Bovine Serum
 High-speed centrifuge Sigma  3K15 Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
 High-speed centrifuge Eppendorf 5424R Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium Dakewe DKW-KLSH-0100 Ficoll-Paque
LS Separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Separation columns
Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnetic bead separator
PE anti-human CD8 Biolegend 344706 Fluorescent antibody 
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 Biolegend 344808 Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS) BI 02-024-1ACS PBS
Polystyrene round bottom tubes Falcon 352235 5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent Ambion 15596024 Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit Beyotime C0011 Trypan Blue Staining

References

  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, L., Liu, M., Zhang, M., Ai, J., Tian, J., Wang, R., Xie, Z. Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis. J. Vis. Exp. (187), e64212, doi:10.3791/64212 (2022).

View Video