Summary

فصل المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المناعية في عينات الدم المحيطية من الأطفال المصابين بكثرة الوحيدات المعدية

Published: September 07, 2022
doi:

Summary

وصفنا طريقة تجمع بين الخرز المغنطيسي المناعي وفرز الخلايا المنشط بالتألق لعزل وتحليل مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (الخلايا الوحيدة ، خلايا CD4 + T ، خلايا CD8 + T ، الخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تنقية الخلايا المغناطيسية والفلورية وتحليلها.

Abstract

عدد كريات الدم البيضاء المعدية (IM) هو متلازمة حادة ترتبط في الغالب بعدوى فيروس إبشتاين بار الأولية (EBV). تشمل الأعراض السريرية الرئيسية الحمى غير المنتظمة ، واعتلال العقد اللمفية ، وزيادة الخلايا الليمفاوية بشكل ملحوظ في الدم المحيطي. لا تزال الآلية المسببة للأمراض في IM غير واضحة. لا توجد طريقة علاج فعالة لذلك ، مع توفر علاجات الأعراض بشكل أساسي. السؤال الرئيسي في علم الأحياء المناعي EBV هو لماذا تظهر مجموعة فرعية صغيرة فقط من الأفراد المصابين أعراضا سريرية حادة وحتى يصابون بأورام خبيثة مرتبطة ب EBV ، في حين أن معظم الأفراد لا تظهر عليهم أعراض مدى الحياة مع الفيروس.

تشارك الخلايا البائية أولا في العضلي؛ لأن مستقبلات EBV تظهر على سطحها. الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي خلايا ليمفاوية فطرية سامة للخلايا مهمة لقتل الخلايا المصابة بفيروس EBV. تنخفض نسبة الخلايا التائية CD4 + بينما تتوسع نسبة الخلايا التائية CD8 + بشكل كبير أثناء عدوى EBV الحادة ، واستمرار الخلايا التائية CD8 + مهم للسيطرة على العضلي مدى الحياة. تلعب هذه الخلايا المناعية أدوارا مهمة في العضل العضلي، ويجب تحديد وظائفها بشكل منفصل. لهذا الغرض ، يتم فصل الخلايا الوحيدة أولا عن خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لأفراد IM باستخدام ميكروبيدات CD14 وعمود وفاصل مغناطيسي.

يتم تلطيخ PBMCs المتبقية ببروتين بيريدين كلوروفيل (PerCP) / سيانين 5.5 مضاد CD3 ، ألوفيكوسيانين (APC) / سيانين 7 مضاد CD4 ، فيكوريثرين (PE) مضاد CD8 ، فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) مضاد CD19 ، APC مضاد CD56 ، و APC مضاد ل CD16 لفرز خلايا CD4 + T وخلايا CD8 + T والخلايا البائية وخلايا NK باستخدام مقياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، تم إجراء تسلسل النسخ لخمس مجموعات سكانية فرعية لاستكشاف وظائفها وآلياتها المسببة للأمراض في IM.

Introduction

فيروس إبشتاين بار (EBV) ، وهو فيروس الهربس γ المعروف أيضا باسم فيروس الهربس البشري من النوع 4 ، موجود في كل مكان في البشر ويؤسس عدوى كامنة مدى الحياة في أكثر من 90٪ من السكان البالغين1. تحدث معظم العدوى الأولية EBV خلال مرحلة الطفولة والمراهقة ، مع ظهور جزء صغير من المرضى مع عدد كريات الدم البيضاء المعدية (IM) 2 ، مما يدل على علم الأمراض المناعية المميزة ، بما في ذلك الاستجابة المناعية النشطة مع خلايا CD8 + T في الدم وانتشار عابر للخلايا البائية المصابة بفيروس EBV في البلعومالفموي 3. قد تستمر دورة الحقن العضلي لمدة 2-6 أسابيع ويتعافى غالبية المرضى بشكل جيد4. ومع ذلك ، يصاب بعض الأفراد بأعراض مستمرة أو متكررة تشبه IM مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات ، والتي تصنف على أنها عدوى EBV المزمنة النشطة (CAEBV)5. بالإضافة إلى ذلك ، يعد EBV فيروسا مهما للأورام ، يرتبط ارتباطا وثيقا بمجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة ، بما في ذلك الأورام الخبيثة الظهارية واللمفاوية مثل سرطان البلعوم البلعومي ، وسرطان الغدد الليمفاوية بوركيت ، وسرطان الغدد الليمفاوية هودجكين (HL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا T / NK6. على الرغم من دراسة EBV لأكثر من 50 عاما ، إلا أن التسبب في المرض والآلية التي يحفز بها تكاثر الخلايا الليمفاوية لم يتم توضيحها بالكامل.

بحثت العديد من الدراسات في التوقيعات الجزيئية لعلم الأمراض المناعي لعدوى EBV عن طريق تسلسل النسخ. قام Zhong et al. بتحليل التنميط الكامل للنسخ لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) من الأطفال الصينيين المصابين ب IM أو CAEBV ليجد أن توسع الخلايا التائية CD8 + تم العثور عليه في الغالب في مجموعة IM7 ، مما يشير إلى أن خلايا CD8 + T قد تلعب دورا رئيسيا في IM. وبالمثل ، وجدت دراسة أخرى نسبا أقل من الخلايا التائية السامة للخلايا وخلايا CD19 + B السامة للخلايا ونسب أعلى من خلايا CD8 + T في المرضى الذين يعانون من IM الناجم عن عدوى EBV الأولية مقارنة بالمرضى الذين يعانون من IM الناجم عن إعادة تنشيط EBV وعوامل أخرى8. تشارك الخلايا البائية أولا في العضلي؛ لأن مستقبلات EBV تظهر على سطحها. وجد الطباع وآخرون أن الخلايا البائية تم تنشيطها متعددة النسيلة وخلايا البلازما المتمايزة (خلايا CD19 + و CD27 + و CD20− و CD138) وخلايا البلازما (CD19 + و CD27 + و CD20 و CD138 +) خلال IM9. علاوة على ذلك ، وجد Zhong et al. أن علامات الخلايا الوحيدة CD14 و CD64 تم تنظيمها في CAEBV ، مما يشير إلى أن الخلايا الوحيدة قد تلعب دورا مهما في الاستجابة المناعية الخلوية ل CAEBV من خلال السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) والبلعمة المفرطة النشاط7. Alka et al. ميز نسخ خلايا CD56 CD16 + NKالخافتة من أربعة مرضى من IM أو HL ووجد أن الخلايا القاتلة الطبيعية من كل من IM و HL قد خفضت المناعة الفطرية وجينات إشارات chemokine ، والتي يمكن أن تكون مسؤولة عن عدم استجابة الخلايا القاتلة الطبيعية10. بالإضافة إلى ذلك ، قام Greenough et al. بتحليل التعبير الجيني لخلايا CD8 + T المصنفة من 10 PBMCs للأفراد المصابين ب IM. وأفادوا أن نسبة كبيرة من الخلايا التائية CD8 + في IM كانت خاصة بالفيروسات ، وتم تنشيطها ، وتقسيمها ، واستعدادها لممارسة أنشطة المستجيب11. تلعب كل من الاستجابات بوساطة الخلايا التائية ، والاستجابات الخاصة ب EBV ، والاستجابات غير المحددة بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية ، أدوارا أساسية أثناء عدوى EBV الأولية. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات بحثت فقط في نتائج النسخ للخليط المتنوع من الخلايا المناعية أو مجموعة فرعية معينة فقط من الخلايا الليمفاوية ، وهو ما لا يكفي للمقارنة الشاملة للخصائص الجزيئية ووظائف مجموعات الخلايا المناعية المختلفة في الأطفال المصابين ب IM في نفس حالة المرض.

تصف هذه الورقة طريقة تجمع بين الخرز المغناطيسي المناعي وفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لعزل وتحليل مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية من PBMCs (الخلايا الوحيدة ، خلايا CD4 + T ، خلايا CD8 + T ، الخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تنقية الخلايا المغناطيسية والفلورية باستخدام فاصل مغناطيسي و FACS أو تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا المنقاة لتسلسل النسخ. ستمكن هذه الطريقة من توصيف الخلايا المناعية المختلفة والتعبير الجيني عنها في نفس حالات المرض للأفراد المصابين بالحقن العضلي ، مما سيوسع فهمنا لعلم الأمراض المناعي لعدوى EBV.

Protocol

تم الحصول على عينات دم من المرضى الذين يعانون من IM (ن = 3) ، وحاملات EBV الأصحاء (ن = 3) ، والأطفال غير المصابين بفيروس EBV (ن = 3). تم تجنيد متطوعين من مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية ، وتمت الموافقة على جميع الدراسات أخلاقيا. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستش…

Representative Results

مرجع استراتيجية البواباتيوضح الشكل 1 استراتيجية البوابة المستخدمة لفرز المجموعات الفرعية الأربعة للخلايا الليمفاوية. باختصار ، يتم اختيار الخلايا الليمفاوية (P1) على مخطط نقطي يوضح التحبب (SSC-A) مقابل الحجم (FSC-A). بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا المفردة (P2) على مخطط نقط…

Discussion

يمثل هذا البروتوكول طريقة فعالة لفرز المجموعات الفرعية للخلايا المناعية للدم المحيطي. في هذه الدراسة ، تم اختيار عينات الدم الوريدي من المرضى الذين يعانون من IM ، وناقلات EBV الأصحاء ، والأطفال غير المصابين بفيروس EBV كهدف بحثي. يركز هذا العمل باستخدام الدم المحيطي لمرضى IM بشكل أساسي على تحلي…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82002130) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7222059) وصندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (2019-I2M-5-026).

Materials

APC anti-human CD16 Biolegend 302012 Fluorescent antibody 
APC anti-human CD56 (NCAM) Biolegend 362504 Fluorescent antibody 
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Biolegend 344616 Fluorescent antibody 
Automated cell counter BIO RAD TC20 Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) Becton, Dickinson and Company 644832 Cell sort
CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201 microbeads
Cell ctng slides BIO RAD 1450016 Cell count
Centrifuge tubes Falcon 35209715 15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium) Beyotime ST1303 EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes Becton, Dickinson and Company  367862  EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19 Biolegend 302206 Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000-044 Fetal Bovine Serum
 High-speed centrifuge Sigma  3K15 Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
 High-speed centrifuge Eppendorf 5424R Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium Dakewe DKW-KLSH-0100 Ficoll-Paque
LS Separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Separation columns
Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnetic bead separator
PE anti-human CD8 Biolegend 344706 Fluorescent antibody 
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 Biolegend 344808 Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS) BI 02-024-1ACS PBS
Polystyrene round bottom tubes Falcon 352235 5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent Ambion 15596024 Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit Beyotime C0011 Trypan Blue Staining

References

  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, L., Liu, M., Zhang, M., Ai, J., Tian, J., Wang, R., Xie, Z. Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis. J. Vis. Exp. (187), e64212, doi:10.3791/64212 (2022).

View Video