Enfeksiyöz Mononükleozlu Çocuklardan Periferik Kan Örneklerinde İmmün Hücre Alt Popülasyonlarının Ayrılması
Summary
Periferik kan mononükleer hücrelerinin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücreler) tanımlanmış bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasını birleştiren bir yöntem tanımladık. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler saflaştırılabilir ve analiz edilebilir.
Abstract
Enfeksiyöz mononükleoz (IM), çoğunlukla primer Epstein-Barr virüsü (EBV) enfeksiyonu ile ilişkili akut bir sendromdur. Başlıca klinik semptomlar düzensiz ateş, lenfadenopati ve periferik kanda önemli ölçüde artmış lenfositlerdir. IM’nin patojenik mekanizması hala belirsizdir; bunun için etkili bir tedavi yöntemi yoktur, esas olarak semptomatik tedaviler mevcuttur. EBV immünobiyolojisindeki ana soru, enfekte bireylerin sadece küçük bir alt kümesinin neden ciddi klinik semptomlar gösterdiği ve hatta EBV ile ilişkili maligniteler geliştirdiği, çoğu bireyin virüsle yaşam boyu asemptomatik olduğudur.
B hücreleri ilk önce IM’ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Doğal öldürücü (NK) hücreler, EBV ile enfekte olmuş hücreleri öldürmek için önemli olan sitotoksik doğuştan gelen lenfositlerdir. CD4 + T hücrelerinin oranı azalırken, CD8 + T hücrelerinin oranı akut EBV enfeksiyonu sırasında dramatik olarak genişler ve CD8 + T hücrelerinin kalıcılığı IM’nin yaşam boyu kontrolü için önemlidir. Bu bağışıklık hücreleri IM’de önemli roller oynar ve işlevlerinin ayrı ayrı tanımlanması gerekir. Bu amaçla, monositler önce CD14 mikroboncukları, bir sütun ve manyetik bir ayırıcı kullanılarak IM bireylerinin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ler) ayrılır.
Kalan PBMC’ler, CD4 + T hücrelerini, CD8 + T hücrelerini, B hücrelerini ve NK hücrelerini bir akış sitometresi kullanarak sıralamak için peridinin-klorofil-protein (PerCP) / Siyanin 5.5 anti-CD3, allofikokosyanin (APC) / Siyanin 7 anti-CD4, fikoeritrin (PE) anti-CD8, floresan izotiyosiyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 ve APC anti-CD16 antikorları ile boyanır. Ayrıca, IM’deki fonksiyonlarını ve patojenik mekanizmalarını araştırmak için beş alt popülasyonun transkriptom dizilimi yapıldı.
Introduction
İnsan herpes virüsü tip 4 olarak da bilinen bir γ-herpes virüsü olan Epstein-Barr virüsü (EBV), insan popülasyonunda her yerde bulunur ve yetişkin nüfusun% 90’ından fazlasında yaşam boyu gizli enfeksiyon oluşturur1. EBV primer enfeksiyonunun çoğu çocukluk ve ergenlik döneminde ortaya çıkar, hastaların bir kısmı enfeksiyöz mononükleoz (IM)2 ile kendini gösterir, kandaki CD8 + T hücreleri ile aktive olmuş bir immün yanıt ve orofarenks3’te EBV ile enfekte B hücrelerinin geçici proliferasyonu dahil olmak üzere karakteristik immünopatoloji gösterir. IM’nin seyri 2-6 hafta sürebilir ve hastaların çoğunluğuiyileşir 4. Bununla birlikte, bazı bireylerde kronik aktif EBV enfeksiyonu (CAEBV)5 olarak sınıflandırılan yüksek morbidite ve mortalite ile kalıcı veya tekrarlayan IM benzeri semptomlar gelişir. Ek olarak, EBV, nazofaringeal karsinom, Burkitt lenfoma, Hodgkin lenfoma (HL) ve T / NK hücreli lenfoma6 gibi epiteloid ve lenfoid maligniteler de dahil olmak üzere çeşitli malignitelerle yakından ilişkili olan önemli bir onkojenik virüstür. EBV 50 yılı aşkın süredir çalışılmasına rağmen, patogenezi ve lenfositlerin proliferasyonunu indüklediği mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır.
Birçok çalışmada transkriptom dizilimi ile EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi için moleküler imzalar araştırılmıştır. Zhong ve ark., CD8 + T hücre genişlemesinin ağırlıklı olarak IM grubu7’de bulunduğunu bulmak için IM veya CAEBV’li Çinli çocuklardan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC’ler) tüm transkriptom profillemesini analiz ettiler ve CD8 + T hücrelerinin IM’de önemli bir rol oynayabileceğini düşündürdüler. Benzer şekilde, başka bir çalışmada, birincil EBV enfeksiyonunun neden olduğu IM’li hastalarda, hem EBV reaktivasyonunun hem de diğer ajanların neden olduğu IM’li hastalara göre daha düşük oranda EBV’ye özgü sitotoksik T ve CD19 + B hücrelerinin daha düşük oranları veCD8 + T hücrelerinin daha yüksek yüzdeleri bulunmuştur. B hücreleri ilk önce IM’ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Al Tabaa ve ark., IM9 sırasında B hücrelerinin poliklonal olarak aktive olduğunu ve intoplazmablastlar (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138− hücreleri) ve plazma hücrelerinin (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138+) farklılaştığını bulmuşlardır. Ayrıca, Zhong ve ark. monosit belirteçleri CD14 ve CD64’ün CAEBV’de yukarı regüle olduğunu bulmuşlardır, bu da monositlerin antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC) ve hiperaktif fagositoz7 yoluyla CAEBV’nin hücresel immün yanıtında önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Alka ve ark., dört IM veya HL hastasından CD56dim CD16 + NK hücrelerini sıralayan MACS’nin transkriptomunu karakterize ettiler ve hem IM hem de HL’den NK hücrelerinin, NK hücrelerinin hipoyanıtlılığından sorumlu olabilecek doğuştan gelen bağışıklık ve kemokin sinyal genlerini aşağı regüle ettiğini bulmuşlardır10. Ek olarak, Greenough ve ark., IM’li bireylerin 10 PBMC’sinden sıralanmış CD8 + T hücrelerinin gen ekspresyonunu analiz ettiler. IM’deki CD8 + T hücrelerinin büyük bir kısmının virüse özgü, aktive edilmiş, bölünen ve efektör aktivitelerini uygulamak için astarlanmış olduğunu bildirmişlerdir11. Hem T hücresi aracılı, EBV’ye özgü yanıtlar hem de NK hücre aracılı, spesifik olmayan yanıtlar primer EBV enfeksiyonu sırasında önemli roller oynamaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar sadece immün hücrelerin çeşitli karışımının veya sadece belirli bir lenfosit alt popülasyonunun transkriptom sonuçlarını araştırmıştır; bu, aynı hastalık durumundaki IM’li çocuklarda farklı immün hücre alt popülasyonlarının moleküler özelliklerinin ve fonksiyonlarının kapsamlı bir şekilde karşılaştırılması için yeterli değildir.
Bu yazıda, PBMC’lerin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri) tanımlanmış immün hücre alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamayı (FACS) birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler manyetik bir ayırıcı ve FACS kullanılarak saflaştırılabilir veya akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA, transkriptom dizilimi için saflaştırılmış hücrelerden ekstrakte edilebilir. Bu yöntem, IM’li bireylerin aynı hastalık durumlarında farklı bağışıklık hücrelerinin karakterizasyonunu ve gen ekspresyonunu sağlayacak ve bu da EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi hakkındaki anlayışımızı genişletecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, periferik kan bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını sıralamanın etkili bir yolunu temsil eder. Bu çalışmada IM’li hastalardan, sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan alınan venöz kan örnekleri araştırma amacı olarak seçilmiştir. IM hastalarının periferik kanını kullanan bu çalışma, esas olarak çok renkli akış sitometrisi yoluyla farklı hücre alt kümelerinin oranlarını analiz etmeye ve belirlemeye odaklanmaktadır. Transkriptom di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82002130), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7222059) ve Tıp Bilimleri için CAMS İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
