En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos

O coração é o primeiro órgão funcional de um embrião de mamíferos. Por volta do dia embrionário (E) 7,5 em camundongos, células mesodérmicas pré-cardíacas bilaterais formam o crescente cardíaco no lado ventral¹. O crescente cardíaco contém duas populações de células pré-cardíacas que incluem progenitores do miocárdio e do endocárdio². Por volta de E8.0, os precursores cardíacos se fundem na linha média, formando o tubo cardíaco primitivo composto por dois tecidos epiteliais, o miocárdio externo e o endocárdio interno, que é um endotélio especializado separado por uma matriz extracelular chamada geleia cardíaca. Mais tarde, em E8.5, o tubo cardíaco sofre looping para a direita. O coração em alça possui diferentes regiões anatômicas com assinaturas moleculares específicas, como a via de saída (OFT), os ventrículos e o canal atrioventricular (AVC)³. Embora inicialmente o tubo cardíaco se expanda em seu lado de entrada através da adição de células⁴, em E9,5, a proliferação cardíaca intensiva resulta em balonamento das câmaras e estabelecimento da rede trabecular⁵. A formação valvar ocorre no AVC (futuras valvas mitral e tricúspide) e no OFT (futuras valvas aórtica e pulmonar).

O endocárdio desempenha papéis cruciais no desenvolvimento da válvula. As células endocárdicas sofrem transição epitelial-mesenquimal (EMT) no AVC e no OFT para formar as almofadas endocárdicas, uma estrutura que aparece no início do desenvolvimento valvar. Diferentes vias de sinalização ativam esse processo; em E9.5 em camundongos, o NOTCH ativado no endocárdio em resposta à BMP2 derivada do miocárdio promove EMT invasiva de células endocárdicas nas regiões AVC e OFT por meio da ativação de TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), que reprime diretamente a expressão da caderina endotelial vascular (VE-caderina), um componente transmembrana das junções aderentes (AJs)^6,7,8 . No OFT, a ativação do endocárdio para iniciar a EMT é mediada pelo FGF8 e BMP4, cuja expressão é ativada pelo NOTCH 9,10,11,12.

A progressão da EMT envolve a dinâmica celular à medida que as células mudam de forma, quebram e refazem junções com seus vizinhos, delaminam e começam a migrar¹³. Essas alterações incluem remodelamento e desmontagem gradual de AJ 14,15, sinalização de polaridade celular planar (PCP), perda de polaridade ápico-basal (PAB), constrição apical e organização citoesquelética ^16,17. ABP refere-se à distribuição de proteínas ao longo do eixo anteroposterior de uma célula. No coração em desenvolvimento, a regulação da PA em cardiomiócitos é necessária para o desenvolvimento ventricular¹⁸. PCP refere-se a uma distribuição polarizada de proteínas dentro das células através do plano de um tecido e regula a distribuição celular; epitélios com geometria estável são constituídos por células em forma de hexágono, onde apenas três células convergem nos vértices 19,20,21,22. Diferentes processos celulares, como divisão celular, troca de vizinhos ou delaminação que ocorrem durante a morfogênese epitelial, produzem um aumento no número de células que convergem para um vértice e no número de células vizinhas que uma determinada célula tem²². Esses comportamentos celulares relacionados à PCP podem ser regulados por diferentes vias de sinalização, dinâmica da actina ou tráfico intracelular²³.

Os dados gerados que estudam o desenvolvimento valvar em camundongos foram obtidos de cortes transversais, coronais ou sagitais de corações embrionários E8.5 e E9.5, onde o endocárdio é mostrado como uma linha de células em vez de como um campo de células – o endocárdio cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco²⁴. Cortes embrionários não permitem a análise de PCP no endocárdio de embriões de camundongos. Nosso novo método experimental permite a análise da distribuição de células endocárdicas, anisotropia AJ e análise da forma de célula única, como mostrado nos resultados representativos. Este tipo de dados é necessário para a análise de PCP, juntamente com a descrição de outras moléculas relacionadas com PCP, não mostradas neste relatório. A imunofluorescência total, o preparo específico de amostras e o uso de camundongos geneticamente modificados permitem a análise de polaridade planar no endocárdio no início do desenvolvimento valvar em camundongos.