En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması
Summary
Klasik olarak, fare embriyonik kapak primordiyumunun endokardiyumu transversal, koronal veya sagital kesitler kullanılarak analiz edilmiştir. Valvulojenik bölgelerde endokardın en yüzlü, iki boyutlu görüntülenmesi için yeni yaklaşımımız, kapak gelişimi sırasında endokardın düzlemsel polarite ve hücre yeniden düzenleme analizine izin verir.
Abstract
Memeli kalbinin gelişiminin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların incelenmesi, insan konjenital kalp hastalığını ele almak için esastır. İlkel kalp kapakçıklarının gelişimi, lokal endüktif miyokard ve endokardiyal sinyallere yanıt olarak endikonitriyal hücrelerin atriyoventriküler kanal (AVC) ve kalbin çıkış yolu (OFT) bölgelerinden epitel-mezenkimal geçişini (EMT) içerir. Hücreler delaminasyona girdiğinde ve endokard ile miyokard arasında bulunan hücre dışı matriksi (kardiyak jöle) istila ettiğinde, ilkel endokardiyal yastıklar (EC) oluşur. Bu işlem, endokardın delamine edilmiş hücreler tarafından bırakılan boşlukları doldurması ve bir eksen boyunca yakınsamak (daralmak) veya uzatmak (uzatmak) için kendini yeniden organize etmesi gerektiği anlamına gelir. Mevcut araştırmalar, bu süreçte yer alan faktörlerin hücre altı lokalizasyonunu düzenlemede düzlemsel hücre polaritesi (PCP) yolunu etkilemiştir. Klasik olarak, kalp kapağı gelişiminin ilk aşamaları, embriyonik kalplerin kesitlerinde veya kollajen jelleri üzerinde kültürlenmiş ex vivo AVC veya OFT eksplantlarında incelenmiştir. Bu yaklaşımlar apiko-bazal polaritenin analizine izin verir, ancak epitel düzlemindeki hücre davranışının veya göç eden hücrelerin morfolojik değişikliklerinin analizine izin vermez. Burada, valvulojenik bölgelerdeki endokardın hücrelerin düzlemsel bir alanı olarak görselleştirilmesini sağlayan deneysel bir yaklaşım sunuyoruz. Bu deneysel yaklaşım, valf gelişimi sırasında OFT ve AVC’nin endokardiyumunda PCP, düzlemsel topoloji ve hücreler arası iletişimi inceleme fırsatı sunar. Kardiyak kapak morfogenezinde rol oynayan yeni hücresel mekanizmaların deşifre edilmesi, endokardiyal yastık defekti ile ilişkili konjenital kalp hastalığının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Introduction
Kalp, bir memeli embriyosunun ilk fonksiyonel organıdır. Farelerde embriyonik gün (E) 7.5 civarında, bilateral prekardiyak mezoderm hücreleri ventral taraftaki kardiyak hilali oluşturur1. Kardiyak hilal, miyokard ve endokard2’nin progenitörlerini içeren iki prekardiyak hücre popülasyonu içerir. E8.0 civarında, kardiyak öncüller orta hatta kaynaşır ve iki epitel dokusundan, dış miyokarddan ve kardiyak jöle adı verilen hücre dışı bir matrisle ayrılmış özel bir endotel olan iç endokarddan oluşan ilkel kalp tüpünü oluşturur. Daha sonra, E8.5’te, kalp tüpü sağa doğru döngüye girer. Döngülü kalp, çıkış yolu (OFT), ventriküller ve atrio-ventriküler kanal (AVC)3 gibi spesifik moleküler imzalara sahip farklı anatomik bölgelere sahiptir. Başlangıçta kalp tüpü,hücre 4’ün eklenmesiyle giriş tarafında genişlemiş olsa da, E9.5’te, yoğun kardiyak proliferasyon, odaların balonlaşmasına ve trabeküler ağın kurulmasına neden olur5. Kapak oluşumu AVC’de (gelecekteki mitral ve triküspid kapaklar) ve OFT’de (gelecekteki aort ve pulmoner kapaklar) gerçekleşir.
Endokard, kapak gelişiminde çok önemli rol oynar. Endokardiyal hücreler, kapak gelişiminin başlangıcında ortaya çıkan bir yapı olan endokardiyal yastıkları oluşturmak için AVC ve OFT’de epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) uğrar. Farklı sinyal yolları bu süreci aktive eder; farelerde E9.5’te, miyokardiyal kaynaklı BMP2’ye yanıt olarak endokardda aktive edilen NOTCH, TGFβ2 ve salyangozun (SNAI1) aktivasyonu yoluyla AVC ve OFT bölgelerindeki endokardiyal hücrelerin invaziv EMT’sini teşvik eder, bu da aderans kavşaklarının (AJ’ler) bir transmembran bileşeni olan vasküler endotelyal kadherinin (VE-kadherin) ekspresyonunu doğrudan bastırır6,7,8 . OFT’de, EMT’yi başlatmak için endokardın aktivasyonu, ifadesi NOTCH 9,10,11,12 tarafından aktive edilen FGF8 ve BMP4 tarafından aracılık edilir.
EMT’nin ilerlemesi, hücreler şekil değiştirirken, komşularıyla kavşakları kırıp yeniden oluştururken, delaminasyona girerken ve göç etmeye başlarken hücresel dinamikleri içerir13. Bu değişiklikler arasında AJ remodelizasyonu ve kademeli olarak sökülmesi14,15, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalizasyonu, apiko-bazal polarite kaybı (ABP), apikal daralma ve sitoiskelet organizasyonu16,17 bulunmaktadır. ABP, proteinlerin bir hücrenin ön-arka ekseni boyunca dağılımını ifade eder. Gelişmekte olan kalpte, ventrikül gelişimi için kardiyomiyositlerde ABP regülasyonu gereklidir18. PCP, proteinlerin bir doku düzlemi boyunca hücreler içindeki polarize dağılımını ifade eder ve hücresel dağılımı düzenler; Kararlı bir geometriye sahip epitelya, altıgen şekilli hücrelerden oluşur ve burada sadece üç hücre19,20,21,22 köşelerinde birleşir. Epitel morfogenezi sırasında meydana gelen hücre bölünmesi, komşu değişimi veya delaminasyon gibi farklı hücresel süreçler, bir köşede birleşen hücrelerin sayısında ve belirli bir hücreninsahip olduğu komşu hücrelerin sayısında bir artış üretir. PCP ile ilgili bu hücresel davranışlar farklı sinyal yolakları, aktin dinamikleri veya hücre içi kaçakçılıktarafından düzenlenebilir 23.
Farelerde kapak gelişimini inceleyen veriler, endokardın bir hücre alanı yerine bir hücre çizgisi olarak gösterildiği E8.5 ve E9.5 embriyonik kalplerinin enine, koronal veya sagital bölümlerinden elde edilmiştir – endokard, kalp tüpünün tüm iç yüzeyini kaplar24. Embriyonik kesitler, fare embriyolarının endokardında PCP analizine izin vermez. Yeni deneysel yöntemimiz, temsili sonuçlarda gösterildiği gibi endokardiyal hücre dağılımının, AJ anizotropisinin ve tek hücreli şekil analizinin analizine izin verir. Bu tür veriler, PCP analizi için, bu raporda gösterilmeyen PCP ile ilgili diğer moleküllerin tanımı ile birlikte gereklidir. Tam montajlı immünofloresan, spesifik numune hazırlama ve genetiği değiştirilmiş farelerin kullanımı, farelerde kapak gelişiminin başlangıcında endokardda düzlemsel polarite analizini mümkün kılar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endokard, embriyonik kalp tüpünün tüm iç yüzeyini kaplayan epitel tek katmanlıdır. Kapak gelişimi sırasında, prospektif kapak bölgelerindeki endokardiyal hücreler EMT’ye maruz kalır, böylece endokardiyal hücreler endokarddan kardiyak jöleye doğru delaminasyon yapmak için sitoiskeletlerini dönüştürür ve yeniden düzenler. Biz ve diğerleri, endokardın 6,8,24,32 hücre sırası olarak gösterildiği E8.5 ve E9.5 embriyonik kalplerinin enine bölümlerini analiz e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, MCIN/AEI/10.13039/501100011033’den J. L. P. J.G.-B.’ye PID2019-104776RB-I00 ve CB16/11/00399 (CIBER CV) hibeleri ile desteklenmiştir. Comunidad de Madrid’den Programa de Atracción de Talento tarafından finanse edildi (2020-5ª / BMD-19729). T.G.-C. Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054) tarafından finanse edilmiştir. MCIN/AEI /10.13039/501100011033 ve FEDER “A way to make Europe” (#ICTS-2018-04-CNIC-16) tarafından ortaklaşa finanse edilen CNIC Mikroskopi ve Dinamik Görüntüleme Birimi, CNIC, ICTS-ReDib’e teşekkür ederiz. Ayrıca A. Galiçya ve L. Méndez’e fare yetiştiriciliği için teşekkür ederiz. Bu yayının maliyeti kısmen Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu’ndan gelen fonlarla desteklendi. CNIC, ISCIII, MCIN ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir ve MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 tarafından finanse edilen bir Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezi’dir (hibe CEX2020-001041-S).
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
