エンフェイス マウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製
Summary
古典的には、マウス胚性弁原基の心内膜は、横切片、冠状切片、または矢状切片を用いて分析されてきた。弁形成領域の心内膜の 顔面2次元イメージングのための私たちの新しいアプローチは、弁発生中の心内膜の平面極性と細胞再配列分析を可能にします。
Abstract
哺乳類の心臓の発達の根底にある細胞および分子メカニズムの研究は、ヒトの先天性心疾患に対処するために不可欠です。原始心臓弁の発達には、局所誘導性心筋および心内膜信号に応答して、心臓の房室管(AVC)および流出路(OFT)領域からの心内膜細胞の上皮から間葉への移行(EMT)が含まれます。細胞が層間剥離し、心内膜と心筋の間に位置する細胞外マトリックス(心臓ゼリー)に浸潤すると、原始心内膜クッション(EC)が形成される。このプロセスは、心内膜が剥離された細胞によって残されたギャップを埋めなければならず、軸に沿って収束(狭く)または伸長(延長)するためにそれ自体を再編成しなければならないことを意味する。現在の研究では、このプロセスに関与する因子の細胞内局在の調節に平面細胞極性(PCP)経路が関与しています。古典的には、心臓弁発生の初期段階は、胚性心臓の断面またはコラーゲンゲル上で培養された ex vivoAVC またはOFT外植片で研究されてきました。これらのアプローチは、アピコ基底極性の分析を可能にするが、上皮の平面内の細胞挙動または移動する細胞の形態学的変化の分析は可能ではない。ここでは、弁形成領域の心内膜を細胞の平面場として可視化できる実験的手法を示す。この実験的アプローチは、弁の発達中のOFTおよびAVCの心内膜内のPCP、平面トポロジー、および細胞間コミュニケーションを研究する機会を提供します。心臓弁の形態形成に関与する新しい細胞メカニズムの解読は、心内膜クッションの欠陥に関連する先天性心疾患の理解に貢献する可能性があります。
Introduction
心臓は哺乳類の胚の最初の機能的な器官です。マウスの胚期(E)7.5日目頃、両側前心臓中胚葉細胞は腹側1に心臓三日月を形成する。心臓三日月には、心筋と心内膜2の前駆細胞を含む前心臓細胞の2つの集団が含まれています。E8.0付近では、心臓前駆体が正中線で融合し、外側心筋と、心臓ゼリーと呼ばれる細胞外マトリックスによって分離された特殊な内皮である内心内膜の2つの上皮組織からなる原始的な心臓管を形成します。その後、E8.5で、心臓管は右向きにループします。ループ心臓には、流出路(OFT)、心室、房室管(AVC)など、特定の分子シグネチャを持つさまざまな解剖学的領域があります3。最初は細胞4の添加により心臓管はその流入側で拡張するが、E9.5では集中的な心臓増殖により、心腔のバルーニングと小柱網5の確立が生じる。弁形成は、AVC(将来の僧帽弁および三尖弁)およびOFT(将来の大動脈弁および肺弁)で行われます。
心内膜は弁の発達に重要な役割を果たします。心内膜細胞は、AVCおよびOFTで上皮間葉転換(EMT)を受けて、弁の発達の開始時に現れる構造である心内膜クッションを形成します。異なるシグナル伝達経路がこのプロセスを活性化します。マウスのE9.5では、心筋由来BMP2に応答して心内膜で活性化されたNOTCHは、TGFβ2およびSNAI(SNAI1)の活性化を介してAVCおよびOFT領域の心内膜細胞の侵襲性EMTを促進し、接着接合部(AJ)の膜貫通成分である血管内皮カドヘリン(VE-カドヘリン)の発現を直接抑制します6,7,8。.OFTでは、EMTを開始するための心内膜の活性化はFGF8およびBMP4によって媒介され、その発現はNOTCH9、10、11、12によって活性化される。
EMTの進行には、細胞が形を変え、隣接する細胞との接合部を壊して作り直し、層間剥離し、移動し始めるときの細胞動態が含まれます13。これらの変化には、AJのリモデリングと段階的な分解14,15、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達、アピコ基底極性(ABP)の喪失、頂端狭窄、および細胞骨格組織が含まれます16,17。ABPは、細胞の前後軸に沿ったタンパク質の分布を指します。発達中の心臓では、心筋細胞におけるABP調節が心室の発達に必要です18。PCPは、組織の平面を横切る細胞内のタンパク質の分極分布を指し、細胞分布を調節します。安定した幾何学を持つ上皮は六角形の細胞で構成されており、頂点19,20,21,22に収束するのは3つの細胞だけです。上皮形態形成中に起こる細胞分裂、隣人交換、または層間剥離などの異なる細胞プロセスは、頂点に収束する細胞の数と、特定の細胞が持つ隣接細胞の数が22増加する。PCPに関連するこれらの細胞挙動は、異なるシグナル伝達経路、アクチン動態、または細胞内輸送によって調節され得る23。
マウスにおける弁の発達を研究するために生成されたデータは、E8.5およびE9.5胚性心臓の横方向、冠状、または矢状切片から得られており、心内膜は細胞の野としてではなく細胞の列として示され、心内膜は心臓管24の内面全体を覆っている。胚切片は、マウス胚の心内膜におけるPCPの分析を可能にしない。我々の新しい実験法は、代表的な結果に示すように、心内膜細胞分布の解析、AJ異方性、および単一細胞形状解析を可能にします。このタイプのデータは、PCPに関連する他の分子の説明とともに、PCP分析に必要ですが、このレポートには示されていません。ホールマウント免疫蛍光法、特異的サンプル調製、および遺伝子改変マウスの使用により、マウスの弁発生開始時の心内膜の平面極性分析が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
心内膜は、胚性心臓管の内面全体を覆う上皮単層である。弁の発達中、将来の弁領域の心内膜細胞はEMTを受けるため、心内膜細胞は細胞骨格を形質転換および再配置して、心内膜から心臓ゼリーに向かって剥離します。私たちらは、心内膜が細胞の列として示されているE8.5およびE9.5胚性心臓の横断切片を分析することにより、マウス胚の弁発生に関する関連データを取得しました<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033からJ. L. P. J.G.-Bへの助成金PID2019-104776RB-I00およびCB16/11/00399(CIBER CV)の支援を受けました。マドリード市(2020-5ª/BMD-19729)のアトラシオン・デ・タレント・プログラムから資金提供を受けました。T.G.-C.Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054)から資金提供を受けた。我々は、MCIN/AEI /10.13039/501100011033とFEDER「ヨーロッパを作る方法」(#ICTS-2018-04-CNIC-16)の共同出資により、CNIC顕微鏡・ダイナミックイメージングユニット(CNIC)、ICTS-ReDibに感謝する。また、A.ガリシアとL.メンデスのマウス飼育にも感謝します。この出版物の費用は、欧州地域開発基金からの資金によって部分的に支えられました。CNICは、ISCIII、MCIN、およびPro CNIC財団によってサポートされており、MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033によって資金提供されたセベロオチョアセンターオブエクセレンス(助成金CEX2020-001041-S)です。
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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