En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

Das Herz ist das erste funktionsfähige Organ eines Säugetierembryos. Um den embryonalen Tag (E) 7,5 bei Mäusen bilden bilaterale präkardiale Mesodermzellen die Herzsichel in der ventralen Seite¹. Die Herzsichel enthält zwei Populationen von Präkardialzellen, die Vorläufer des Myokards und des Endokards^{enthalten 2}. Um E8.0 verschmelzen die Herzvorläufer in der Mittellinie und bilden die primitive Herzröhre, die aus zwei Epithelgeweben, dem äußeren Myokard und dem inneren Endokard besteht, das ein spezialisiertes Endothel ist, das durch eine extrazelluläre Matrix namens Herzgelee getrennt ist. Später, bei E8,5, erfährt der Herzschlauch eine Rechtsschleife. Das geschlungene Herz hat verschiedene anatomische Regionen mit spezifischen molekularen Signaturen wie den Ausflusstrakt (OFT), die Ventrikel und den atriventrikulären Kanal (AVC)³. Obwohl sich der Herzschlauch zunächst an seiner Zuflussseite durch die Hinzufügung von Zellen⁴ ausdehnt, führt die intensive Herzproliferation bei E9,5 zu einer Ballonbildung der Kammern und zur Etablierung des trabekulären Netzwerks⁵. Die Klappenbildung findet in der AVC (zukünftige Mitral- und Trikuspidalklappen) und in der OFT (zukünftige Aorten- und Pulmonalklappen) statt.

Das Endokard spielt eine entscheidende Rolle bei der Klappenentwicklung. Endokardzellen durchlaufen einen epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) im AVC und OFT, um die endokardialen Kissen zu bilden, eine Struktur, die zu Beginn der Klappenentwicklung auftritt. Verschiedene Signalwege aktivieren diesen Prozess; bei E9,5 bei Mäusen fördert NOTCH, das im Endokard als Reaktion auf myokardial abgeleitetes BMP2 aktiviert wird, die invasive EMT von Endokardzellen in den AVC- und OFT-Regionen durch Aktivierung von TGFβ2 und SNAIL (SNAI1), die die Expression von vaskulärem endothelialem Cadherin (VE-Cadherin), einer Transmembrankomponente von Adherens Junctions (AJs), direkt unterdrückt6,7,8 . Im OFT wird die Aktivierung des Endokards zur Initiierung von EMT durch FGF8 und BMP4 vermittelt, deren Expression durch NOTCH 9,10,11,12 aktiviert wird.

Das Fortschreiten von EMT beinhaltet die zelluläre Dynamik, wenn Zellen ihre Form ändern, Verbindungen mit ihren Nachbarn brechen und neu bilden, delaminieren und beginnen zu wandern¹³. Diese Veränderungen umfassen AJ-Remodellierung und allmähliche Demontage 14,15, planare Zellpolarität (PCP) -Signalisierung, den Verlust der apiko-basalen Polarität (ABP), apikale Konstriktion und zytoskelettale Organisation ^16,17. ABP bezieht sich auf die Verteilung von Proteinen entlang der vorder-hinteren Achse einer Zelle. Im sich entwickelnden Herzen ist eine ABP-Regulation in Kardiomyozyten für die ventrikuläre Entwicklung erforderlich¹⁸. PCP bezieht sich auf eine polarisierte Verteilung von Proteinen innerhalb von Zellen über die Ebene eines Gewebes und reguliert die zelluläre Verteilung; Epithelien mit einer stabilen Geometrie bestehen aus sechseckigen Zellen, in denen nur drei Zellen an den Eckpunkten 19,20,21,22 zusammenlaufen. Verschiedene zelluläre Prozesse, wie Zellteilung, Nachbaraustausch oder Delaminierung, die während der epithelialen Morphogenese auftreten, führen zu einer Zunahme der Anzahl der Zellen, die auf einem Scheitelpunkt konvergieren, und der Anzahl der benachbarten Zellen, die eine bestimmte Zelle hat²². Diese zellulären Verhaltensweisen im Zusammenhang mit PCP können durch verschiedene Signalwege, Aktindynamik oder intrazellulären Transport reguliert werden²³.

Die Daten, die zur Untersuchung der Klappenentwicklung bei Mäusen generiert wurden, stammen aus transversalen, koronalen oder sagittalen Abschnitten von E8,5- und E9,5-embryonalen Herzen, wobei das Endokard als Zelllinie und nicht als Zellfeld dargestellt wird – das Endokard bedeckt die gesamte innere Oberfläche der Herzröhre²⁴. Embryonale Schnitte erlauben keine Analyse von PCP im Endokard von Mausembryonen. Unsere neuartige experimentelle Methode ermöglicht die Analyse der endokardialen Zellverteilung, der AJ-Anisotropie und der Einzelzellformanalyse, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt. Diese Art von Daten ist für die PCP-Analyse erforderlich, zusammen mit der Beschreibung anderer Moleküle, die mit PCP verwandt sind und in diesem Bericht nicht aufgeführt sind. Die vollständige Immunfluoreszenz, die spezifische Probenvorbereitung und der Einsatz gentechnisch veränderter Mäuse ermöglichen eine planare Polaritätsanalyse im Endokard zu Beginn der Klappenentwicklung bei Mäusen.