En Face تحضير وسادة الشغاف لتحليل التشكل المستوي في أجنة الفئران
Summary
كلاسيكيا ، تم تحليل الشغاف من بدائية الصمام الجنيني للفأر باستخدام أقسام مستعرضة أو إكليلية أو سهمية. يسمح نهجنا الجديد للوجه والتصوير ثنائي الأبعاد للشغاف في المناطق الصمامية بالقطبية المستوية وتحليل إعادة ترتيب الخلايا للشغاف أثناء تطوير الصمام.
Abstract
تعد دراسة الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تطور قلب الثدييات أمرا ضروريا لمعالجة أمراض القلب الخلقية البشرية. يتضمن تطوير صمامات القلب البدائية الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) لخلايا الشغاف من القناة الأذينية البطينية (AVC) ومناطق تدفق القلب (OFT) استجابة لإشارات عضلة القلب والشغاف الاستقرائية المحلية. بمجرد أن تنفصل الخلايا وتغزو المصفوفة خارج الخلية (هلام القلب) الموجودة بين الشغاف وعضلة القلب ، تتشكل وسائد الشغاف البدائية (EC). تشير هذه العملية إلى أن الشغاف يجب أن يملأ الفجوات التي خلفتها الخلايا غير المبطنة ويجب أن يعيد تنظيم نفسه للتقارب (الضيق) أو التمدد (الإطالة) على طول المحور. وقد تورط البحث الحالي مسار قطبية الخلية المستوية (PCP) في تنظيم التوطين تحت الخلوي للعوامل المشاركة في هذه العملية. كلاسيكيا، تمت دراسة المراحل الأولية لتطور صمام القلب في المقاطع العرضية للقلوب الجنينية أو في النباتات خارج الجسم الحي AVC أو OFT المستزرعة على جل الكولاجين. تسمح هذه الأساليب بتحليل القطبية القاعدية ولكنها لا تسمح بتحليل سلوك الخلية داخل مستوى الظهارة أو التغيرات المورفولوجية للخلايا المهاجرة. هنا ، نعرض نهجا تجريبيا يسمح بتصور الشغاف في المناطق الصمامية كحقل مستو للخلايا. يوفر هذا النهج التجريبي الفرصة لدراسة PCP ، والطوبولوجيا المستوية ، والاتصال بين الخلايا داخل الشغاف في OFT و AVC أثناء تطوير الصمام. قد يساهم فك رموز الآليات الخلوية الجديدة المشاركة في تكوين صمام القلب في فهم أمراض القلب الخلقية المرتبطة بعيوب وسادة الشغاف.
Introduction
القلب هو أول عضو وظيفي لجنين الثدييات. حول اليوم الجنيني (E) 7.5 في الفئران ، تشكل خلايا الأديم المتوسط قبل القلب الثنائية الهلال القلبي في الجانب البطني1. يحتوي الهلال القلبي على مجموعتين من الخلايا قبل القلبية التي تشمل أسلاف عضلة القلب والشغاف2. حوالي E8.0 ، تندمج السلائف القلبية في خط الوسط ، وتشكل أنبوب القلب البدائي الذي يتكون من نسيجين ظهاريين ، عضلة القلب الخارجية ، والشغاف الداخلي ، وهو بطانة متخصصة مفصولة بمصفوفة خارج الخلية تسمى هلام القلب. في وقت لاحق ، في E8.5 ، يخضع أنبوب القلب لحلقات يمنية. يحتوي القلب الحلقي على مناطق تشريحية مختلفة ذات توقيعات جزيئية محددة مثل قناة التدفق (OFT) والبطينين والقناة الأذينية البطينية (AVC)3. على الرغم من أن أنبوب القلب يتوسع في البداية في جانب التدفق من خلال إضافة الخلايا4 ، عند E9.5 ، يؤدي الانتشار القلبي المكثف إلى تضخم الغرف وإنشاء الشبكة التربيقية5. يحدث تكوين الصمام في AVC (الصمامات التاجية وثلاثية الشرف المستقبلية) وفي OFT (الصمامات الأبهرية والرئوية المستقبلية).
يلعب الشغاف أدوارا حاسمة في تطوير الصمام. تخضع خلايا الشغاف للانتقال الظهاري الوسيط (EMT) في AVC و OFT لتشكيل وسائد الشغاف ، وهي بنية تظهر في بداية تطور الصمام. تعمل مسارات الإشارات المختلفة على تنشيط هذه العملية ؛ في E9.5 في الفئران ، يعزز NOTCH المنشط في الشغاف استجابة ل BMP2 المشتق من عضلة القلب EMT الغازية لخلايا الشغاف في مناطق AVC و OFT من خلال تنشيط TGFβ2 و SNAIL (SNAI1) ، الذي يقمع مباشرة التعبير عن الكاديرين البطاني الوعائي (VE-cadherin) ، وهو مكون عبر الغشاء من تقاطعات الملتصقة (AJs) 6،7،8 . في OFT ، يتم تنشيط الشغاف لبدء EMT بواسطة FGF8 و BMP4 ، الذي يتم تنشيط تعبيره بواسطة NOTCH9،10،11،12.
يتضمن تقدم EMT ديناميكيات خلوية حيث تغير الخلايا شكلها ، وتكسر وتعيد تشكيل التقاطعات مع جيرانها ، وتتحلل ، وتبدأ في الهجرة13. تشمل هذه التغييرات إعادة تشكيل AJ والتفكيك التدريجي 14,15 ، وإشارات قطبية الخلية المستوية (PCP) ، وفقدان القطبية القاعدية (ABP) ، والانقباض القمي ، والتنظيم الهيكلي الخلوي 16,17. يشير ABP إلى توزيع البروتينات على طول المحور الأمامي الخلفي للخلية. في القلب النامي ، مطلوب تنظيم ABP في خلايا عضلة القلب لتطوير البطين18. يشير PCP إلى التوزيع المستقطب للبروتينات داخل الخلايا عبر مستوى الأنسجة وينظم التوزيع الخلوي. تتكون الظهارة ذات الهندسة المستقرة من خلايا سداسية الشكل ، حيث تتلاقى ثلاث خلايا فقط عند الرؤوس19،20،21،22. تنتج العمليات الخلوية المختلفة ، مثل انقسام الخلايا أو تبادل الجيران أو التفريغ الذي يحدث أثناء التشكل الطلائي ، زيادة في عدد الخلايا التي تتقارب على قمة وعدد الخلايا المجاورة التي تحتوي عليها خلية معينة22. يمكن تنظيم هذه السلوكيات الخلوية المتعلقة ب PCP من خلال مسارات إشارات مختلفة أو ديناميكيات الأكتين أو الاتجار داخل الخلايا23.
تم الحصول على البيانات الناتجة عن دراسة تطور الصمام في الفئران من المقاطع المستعرضة أو الإكليلية أو السهمية للقلوب الجنينية E8.5 و E9.5 ، حيث يظهر الشغاف كخط من الخلايا بدلا من كونه مجالا من الخلايا – يغطي الشغاف السطح الداخلي بالكامل لأنبوب القلب24. لا تسمح الأقسام الجنينية بتحليل PCP في شغاف أجنة الفئران. تسمح طريقتنا التجريبية الجديدة بتحليل توزيع خلايا الشغاف ، وتباين الخواص AJ ، وتحليل شكل الخلية الواحدة ، كما هو موضح في النتائج التمثيلية. هذا النوع من البيانات مطلوب لتحليل PCP ، جنبا إلى جنب مع وصف الجزيئات الأخرى المتعلقة ب PCP ، غير الموضحة في هذا التقرير. يتيح التألق المناعي الكامل ، وإعداد العينات المحددة واستخدام الفئران المعدلة وراثيا تحليل القطبية المستوية في الشغاف في بداية تطور الصمام في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
الشغاف عبارة عن طبقة أحادية ظهارية تغطي السطح الداخلي لأنبوب القلب الجنيني بالكامل. أثناء تطور الصمام ، تخضع خلايا الشغاف في مناطق الصمامات المحتملة ل EMT ، وبالتالي تقوم خلايا الشغاف بتحويل وإعادة ترتيب هيكلها الخلوي للانفصال من الشغاف نحو الهلام القلبي. لقد حصلنا نحن وآخرون على البيانات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بالمنح PID2019-104776RB-I00 و CB16/11/00399 (CIBER CV) من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 إلى J. L. P. J.G.-B. تم تمويله من قبل برنامج Atracción de Talento من Comunidad de Madrid (2020-5ª / BMD-19729). تي جي سي. بتمويل من منظمة Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). نشكر وحدة CNIC للفحص المجهري والتصوير الديناميكي ، CNIC ، ICTS-ReDib ، بتمويل مشترك من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 و FEDER “طريقة لجعل أوروبا” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). نشكر أيضا A. Galicia و L. Méndez على تربية الفئران. ودعمت تكلفة هذا المنشور جزئيا بأموال من الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية. يتم دعم CNIC من قبل ISCIII و MCIN ومؤسسة Pro CNIC وهو مركز Severo Ochoa للتميز (منحة CEX2020-001041-S) بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
