En Face Preparazione del cuscino endocardico per l'analisi della morfogenesi planare negli embrioni di topo

Il cuore è il primo organo funzionale di un embrione di mammifero. Intorno al giorno embrionale (E) 7,5 nei topi, le cellule bilaterali del mesoderma precardiaco formano la mezzaluna cardiaca nel lato ventrale¹. La mezzaluna cardiaca contiene due popolazioni di cellule precardiache che includono progenitori del miocardio e dell’endocardio². Intorno a E8.0, i precursori cardiaci si fondono nella linea mediana, formando il tubo cardiaco primitivo costituito da due tessuti epiteliali, il miocardio esterno e l’endocardio interno, che è un endotelio specializzato separato da una matrice extracellulare chiamata gelatina cardiaca. Successivamente, a E8.5, il tubo cardiaco subisce un ciclo verso destra. Il cuore ad anello ha diverse regioni anatomiche con firme molecolari specifiche come il tratto di efflusso (OFT), i ventricoli e il canale atrio-ventricolare (AVC)³. Sebbene inizialmente il tubo cardiaco si espanda sul suo lato di afflusso attraverso l’aggiunta di cellule⁴, a E9.5, un’intensa proliferazione cardiaca provoca il palloncino delle camere e la creazione della rete trabecolare⁵. La formazione valvolare avviene nell’AVC (future valvole mitrale e tricuspide) e nell’OFT (future valvole aortica e polmonare).

L’endocardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della valvola. Le cellule endocardiche subiscono una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nell’AVC e nell’OFT per formare i cuscini endocardici, una struttura che appare all’inizio dello sviluppo valvolare. Diverse vie di segnalazione attivano questo processo; a E9.5 nei topi, NOTCH attivato nell’endocardio in risposta al BMP2 derivato dal miocardio promuove l’EMT invasiva delle cellule endocardiche nelle regioni AVC e OFT attraverso l’attivazione di TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), che reprime direttamente l’espressione della caderina endoteliale vascolare (VE-caderina), una componente transmembrana delle giunzioni aderenti (AJ)^6,7,8 . Nell’OFT, l’attivazione dell’endocardio per iniziare l’EMT è mediata da FGF8 e BMP4, la cui espressione è attivata da NOTCH 9,10,11,12.

La progressione dell’EMT coinvolge la dinamica cellulare mentre le cellule cambiano forma, rompono e ricreano le giunzioni con i loro vicini, si delaminano e iniziano a migrare¹³. Questi cambiamenti includono il rimodellamento di AJ e il graduale disassemblaggio 14,15, la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP), la perdita della polarità apico-basale (ABP), la costrizione apicale e l’organizzazione citoscheletrica ^16,17. ABP si riferisce alla distribuzione delle proteine lungo l’asse antero-posteriore di una cellula. Nel cuore in via di sviluppo, la regolazione dell’ABP nei cardiomiociti è necessaria per lo sviluppo ventricolare¹⁸. PCP si riferisce a una distribuzione polarizzata di proteine all’interno delle cellule attraverso il piano di un tessuto e regola la distribuzione cellulare; Gli epiteli con una geometria stabile sono costituiti da cellule di forma esagonale, dove solo tre celle convergono ai vertici 19,20,21,22. Diversi processi cellulari, come la divisione cellulare, lo scambio di vicini o la delaminazione che si verificano durante la morfogenesi epiteliale, producono un aumento del numero di cellule che convergono su un vertice e il numero di cellule vicine che una data cellula ha²². Questi comportamenti cellulari correlati alla PCP possono essere regolati da diverse vie di segnalazione, dinamica dell’actina o traffico intracellulare²³.

I dati generati studiando lo sviluppo valvolare nei topi sono stati ottenuti da sezioni trasversali, coronali o sagittali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l’endocardio è mostrato come una linea di cellule anziché come un campo di cellule: l’endocardio copre l’intera superficie interna del tubo cardiaco²⁴. Le sezioni embrionali non consentono l’analisi del PCP nell’endocardio degli embrioni di topo. Il nostro nuovo metodo sperimentale consente l’analisi della distribuzione delle cellule endocardiche, dell’anisotropia AJ e dell’analisi della forma a singola cellula, come mostrato nei risultati rappresentativi. Questo tipo di dati è necessario per l’analisi del PCP, insieme alla descrizione di altre molecole correlate al PCP, non mostrate in questo rapporto. L’immunofluorescenza a montaggio intero, la preparazione di campioni specifici e l’uso di topi geneticamente modificati consentono l’analisi della polarità planare nell’endocardio all’inizio dello sviluppo valvolare nei topi.