דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה והכתמה של מיטוכונדריה עצבית בתאים מיקרופלואידיים. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מאפשר טיפול סלקטיבי במיטוכונדריה באקסונים כדי לנתח את תכונותיהם בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מבלי להשפיע על תא גוף התא.
Abstract
מיטוכונדריה הם הספקים העיקריים של ATP (אדנוזין טריפוספט) בתאי עצב. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא פנוטיפ נפוץ במחלות נוירודגנרטיביות רבות. בהתחשב בארכיטקטורה המשוכללת ובאורך הקיצוני של חלק מהאקסונים, אין זה מפתיע שהמיטוכונדריה באקסונים יכולה לחוות סביבות שונות בהשוואה למקביליהם בגוף התא. באופן מעניין, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה האקסונלית לעתים קרובות קודם להשפעות על גוף התא. כדי ליצור מודלים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במבחנה, התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים טיפול במיטוכונדריה אקסונאלית מבלי להשפיע על המיטוכונדריה הסומאלית. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מונע דיפוזיה של מולקולות כנגד השיפוע, ובכך מאפשר ניתוח של תכונות המיטוכונדריה בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מקומיים בתוך האקסונים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס במכשירים מיקרופלואידיים, הכתמה בצבע רגיש פוטנציאלי לממברנה, טיפול ברעלן מיטוכונדריאלי, והניתוח המיקרוסקופי שלאחר מכן. שיטה רב-תכליתית זו לחקר הביולוגיה האקסונאלית יכולה להיות מיושמת על הפרעות פרמקולוגיות רבות וקריאות הדמיה, והיא מתאימה למספר תת-סוגים עצביים.
Introduction
מיטוכונדריה הם הספקים העיקריים של ATP (אדנוזין טריפוספט) בתאי עצב. מכיוון שבריאות עצבית קשורה קשר הדוק לתפקוד המיטוכונדריה, אין זה מפתיע כי ויסות לא מתפקד של אברונים אלה נקשר עם הופעת מחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון1. יתר על כן, שיכרון מיטוכונדריאלי שימש בהצלחה למודל תסמיני פרקינסון בבעלי חיים2. הן במודלים של בעלי חיים והן במחלות אנושיות, מותם של תאי עצב מתחיל בחלקים הדיסטליים 3,4, מה שמרמז על כך שהמיטוכונדריה האקסונלית עשויה להיות רגישה יותר לעלבונות. עם זאת, הביולוגיה של המיטוכונדריה באקסונים אינה מובנת היטב בשל הקשיים הקשורים לטיפול ממוקד וניתוח של מיטוכונדריה אקסונאלית ללא הפרעה בו זמנית של תהליכים בגוף התא.
ההתקדמות האחרונה בטכניקות culturing של נוירונים מנותקים במבחנה מאפשרת כעת הפרדה נוזלית של אקסונים וגופי תאים באמצעות התקנים מיקרופלואידיים5. כפי שמתואר באיור 1A, המכשירים האלה כוללים ארבע בארות גישה (a/h ו-c/i), עם שני ערוצים המחברים כל זוג (d ו-f). הערוצים הגדולים מחוברים זה לזה בסדרה של מיקרו-ערוצים באורך 450 מיקרומטר (e). הבדלים מכוונים ברמות המילוי בין שני התאים יוצרים שיפוע לחץ נוזל (איור 1B) שמונע דיפוזיה של מולקולות קטנות מהתעלה עם רמת נוזל נמוכה יותר לצד השני (איור 1C, מודגם בצבע כחול טריפאן).
לאחרונה השתמשנו בהתקנים מיקרופלואידיים כדי לחקור את דרישות התרגום המקומיות במיטופגיה אקסונאלית, הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה6. בפרוטוקול הנוכחי מוצגים צעדים שונים לגרימת נזק מיטוכונדריאלי מקומי באמצעות טיפול סלקטיבי באקסונים באמצעות מעכב קומפלקס מיטוכונדריאלי III Antimycin A 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזרוע ולתרבת נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס במכשיר מיקרופלואידי לטיפול במיטוכונדריה אקסונאלית בנפרד. התועלת של גישה זו עם הצבע הרגיש לממברנה TMRE ומעכב III המורכב Antimycin A (כפי שהוכח בעבר7) מודגמת כאן, אך ניתן להתאים שיטה זו בקלות לצבעים מיטוכונדריאליים אח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר הגרמנית (HA 7728/2-1 ו- EXC2145 Project ID 390857198) ואגודת מקס פלנק.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson’s disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
