Dépolarisation sélective des mitochondries axonales assistée par microfluidique
Summary
Le présent protocole décrit l’ensemencement et la coloration des mitochondries neuronales dans des chambres microfluidiques. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres permet le traitement sélectif des mitochondries dans les axones pour analyser leurs propriétés en réponse à des défis pharmacologiques sans affecter le compartiment du corps cellulaire.
Abstract
Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Le dysfonctionnement mitochondrial est un phénotype courant dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Compte tenu de l’architecture élaborée et de la longueur extrême de certains axones, il n’est pas surprenant que les mitochondries dans les axones puissent connaître des environnements différents de ceux de leurs homologues du corps cellulaire. Fait intéressant, le dysfonctionnement des mitochondries axonales précède souvent les effets sur le corps cellulaire. Pour modéliser le dysfonctionnement mitochondrial axonal in vitro, des dispositifs microfluidiques permettent de traiter les mitochondries axonales sans affecter les mitochondries somales. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres empêche la diffusion des molécules contre le gradient, permettant ainsi l’analyse des propriétés mitochondriales en réponse aux défis pharmacologiques locaux au sein des axones. Le protocole actuel décrit l’ensemencement des neurones dissociés de l’hippocampe dans des dispositifs microfluidiques, la coloration avec un colorant sensible au potentiel membranaire, le traitement avec une toxine mitochondriale et l’analyse microscopique subséquente. Cette méthode polyvalente pour étudier la biologie axonale peut être appliquée à de nombreuses perturbations pharmacologiques et lectures d’imagerie, et convient à plusieurs sous-types neuronaux.
Introduction
Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Comme la santé neuronale est intimement liée à la fonction mitochondriale, il n’est pas surprenant que la régulation dysfonctionnelle de ces organites ait été associée à l’apparition de diverses maladies neurodégénératives, dont la maladie de Parkinson1. De plus, l’intoxication mitochondriale a été utilisée avec succès pour modéliser les symptômes parkinsoniens chez les animaux2. Dans les modèles animaux et les maladies humaines, la disparition des neurones commence aux parties distales3,4, ce qui suggère que les mitochondries axonales pourraient être plus sensibles aux insultes. Cependant, la biologie des mitochondries dans les axones n’est pas bien comprise en raison des difficultés associées au traitement ciblé et à l’analyse des mitochondries axonales sans perturbation simultanée des processus du corps cellulaire.
Les progrès récents dans les techniques de culture de neurones dissociés in vitro permettent maintenant la séparation fluidique des axones et des corps cellulaires grâce à des dispositifs microfluidiques5. Comme le montre la figure 1A, ces dispositifs comportent quatre puits d’accès (a/h et c/i), avec deux canaux reliant chaque paire (d et f). Les grands canaux sont reliés entre eux par une série de microcanaux de 450 μm de long (e). Les différences intentionnelles dans les niveaux de remplissage entre les deux chambres créent un gradient de pression du fluide (Figure 1B) qui empêche la diffusion de petites molécules du canal avec un niveau de fluide inférieur de l’autre côté (Figure 1C, illustrée avec un colorant bleu trypan).
Nous avons récemment utilisé des dispositifs microfluidiques pour étudier les besoins de traduction locale en mitophagie axonale, l’élimination sélective des mitochondries endommagées6. Dans le présent protocole, différentes étapes sont présentées pour induire des lésions mitochondriales locales par traitement sélectif des axones à l’aide de l’inhibiteur du complexe mitochondrial III Antimycine A 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole décrit une méthode pour ensemencer et cultiver des neurones hippocampiques dissociés dans un dispositif microfluidique pour traiter séparément les mitochondries axonales. L’utilité de cette approche avec le colorant TMRE sensible à la membrane et l’inhibiteur complexe III Antimycin A (comme démontré précédemment7) est démontrée ici, mais cette méthode peut être facilement adaptée à d’autres colorants mitochondriaux ou capteurs génétiquement codés des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la Fondation allemande pour la recherche (HA 7728/2-1 et EXC2145 Project ID 390857198) et la Société Max Planck.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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