Aksonal Mitokondrinin Mikroakışkanlar Yardımlı Seçici Depolarizasyonu
Summary
Mevcut protokol, nöronal mitokondrinin mikroakışkan odalarda tohumlanmasını ve boyanmasını tanımlamaktadır. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, aksonlardaki mitokondrilerin, hücre gövdesi bölmesini etkilemeden farmakolojik zorluklara yanıt olarak özelliklerini analiz etmek için seçici tedavisine izin verir.
Abstract
Mitokondri, nöronlardaki ATP’nin (adenozin trifosfat) birincil tedarikçileridir. Mitokondriyal disfonksiyon birçok nörodejeneratif hastalıkta sık görülen bir fenotiptir. Bazı aksonların ayrıntılı mimarisi ve aşırı uzunluğu göz önüne alındığında, aksonlardaki mitokondrilerin hücre gövdesindeki meslektaşlarına kıyasla farklı ortamlar yaşayabilmesi şaşırtıcı değildir. İlginç bir şekilde, aksonal mitokondrinin işlev bozukluğu genellikle hücre gövdesi üzerindeki etkilerden önce gelir. Aksonal mitokondriyal disfonksiyonu in vitro olarak modellemek için, mikroakışkan cihazlar somal mitokondrileri etkilemeden aksonal mitokondrinin tedavisine izin verir. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, moleküllerin gradyana karşı difüzyonunu önler, böylece aksonlar içindeki lokal farmakolojik zorluklara yanıt olarak mitokondriyal özelliklerin analizine izin verir. Mevcut protokol, ayrışmış hipokampal nöronların mikroakışkan cihazlarda tohumlanmasını, membran potansiyeline duyarlı bir boya ile boyanmasını, mitokondriyal toksin ile tedaviyi ve ardından mikroskobik analizi açıklamaktadır. Aksonal biyolojiyi incelemek için bu çok yönlü yöntem, birçok farmakolojik pertürbasyona ve görüntüleme okumalarına uygulanabilir ve çeşitli nöronal alt tipler için uygundur.
Introduction
Mitokondri, nöronlardaki ATP’nin (adenozin trifosfat) ana tedarikçileridir. Nöronal sağlık mitokondriyal fonksiyonla yakından bağlantılı olduğundan, bu organellerin işlevsiz düzenlenmesinin Parkinson hastalığı1 de dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ile ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Ayrıca, mitokondriyal zehirlenme, hayvanlarda Parkinson semptomlarını modellemek için başarıyla kullanılmıştır2. Hem hayvan modellerinde hem de insan hastalığında, nöronların ölümü distal kısımlar 3,4’te başlar ve aksonal mitokondrinin hakaretlere daha duyarlı olabileceğini ima eder. Bununla birlikte, aksonlardaki mitokondrinin biyolojisi, hücre gövdesi süreçlerinin eşzamanlı olarak bozulması olmadan aksonal mitokondrinin hedeflenen tedavisi ve analizi ile ilgili zorluklar nedeniyle iyi anlaşılmamıştır.
Ayrışmış nöronların in vitro kültürleme tekniklerindeki son gelişmeler artık mikroakışkan cihazlar aracılığıyla aksonların ve hücre cisimlerinin akışkan olarak ayrılmasına izin vermektedir5. Şekil 1A’da gösterildiği gibi, bu cihazlar her bir çifti (d ve f) birbirine bağlayan iki kanala sahip dört erişim kuyusuna (a / s ve c / i) sahiptir. Büyük kanallar birbirine 450 μm uzunluğundaki bir dizi mikro kanal (e) ile bağlanır. İki oda arasındaki dolum seviyelerindeki kasıtlı farklılıklar, küçük moleküllerin daha düşük sıvı seviyesine sahip kanaldan diğer tarafa difüzyonunu önleyen bir sıvı basınç gradyanı oluşturur (Şekil 1B) (Şekil 1C, Tripan mavisi boya ile gösterilmiştir).
Son zamanlarda, aksonal mitofajideki yerel çeviri gereksinimlerini, hasarlı mitokondri 6’nın seçici olarak uzaklaştırılmasını incelemek için mikroakışkan cihazlarkullandık. Bu protokolde, mitokondriyal kompleks III inhibitörü Antimisin A 6,7 kullanılarak aksonların seçici tedavisi yoluyla lokal mitokondriyal hasarı indüklemek için farklı adımlar sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, aksonal mitokondrileri ayrı ayrı tedavi etmek için mikroakışkan bir cihazda ayrışmış hipokampal nöronları tohumlamak ve kültürlemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşımın membrana duyarlı boya TMRE ve kompleks III inhibitörü Antimisin A (daha önce gösterildiği gibi7) ile faydası burada gösterilmiştir, ancak bu yöntem diğer mitokondriyal boyalara veya lokal, mikroskopi tabanlı okumalara izin veren mitokondriyal fonksiyonların genetik olarak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (HA 7728/2-1 ve EXC2145 Proje Kimliği 390857198) ve Max Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson’s disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
