Depolarizzazione selettiva assistita da microfluidica dei mitocondri assonali
Summary
Il presente protocollo descrive la semina e la colorazione dei mitocondri neuronali in camere microfluidiche. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere consente il trattamento selettivo dei mitocondri negli assoni per analizzare le loro proprietà in risposta alle sfide farmacologiche senza influenzare il compartimento corporeo cellulare.
Abstract
I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. La disfunzione mitocondriale è un fenotipo comune in molte malattie neurodegenerative. Data l’architettura elaborata e l’estrema lunghezza di alcuni assoni, non sorprende che i mitocondri negli assoni possano sperimentare ambienti diversi rispetto alle loro controparti del corpo cellulare. È interessante notare che la disfunzione dei mitocondri assonali spesso precede gli effetti sul corpo cellulare. Per modellare la disfunzione mitocondriale assonale in vitro, i dispositivi microfluidici consentono il trattamento dei mitocondri assonali senza influenzare i mitocondri somali. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere impedisce la diffusione delle molecole contro il gradiente, consentendo così l’analisi delle proprietà mitocondriali in risposta alle sfide farmacologiche locali all’interno degli assoni. L’attuale protocollo descrive la semina di neuroni ippocampali dissociati in dispositivi microfluidici, la colorazione con un colorante sensibile al potenziale di membrana, il trattamento con una tossina mitocondriale e la successiva analisi microscopica. Questo metodo versatile per studiare la biologia assonale può essere applicato a molte perturbazioni farmacologiche e letture di imaging ed è adatto a diversi sottotipi neuronali.
Introduction
I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. Poiché la salute neuronale è intimamente legata alla funzione mitocondriale, non sorprende che la regolazione disfunzionale di questi organelli sia stata associata all’insorgenza di varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson1. Inoltre, l’intossicazione mitocondriale è stata utilizzata con successo per modellare i sintomi parkinsoniani negli animali2. Sia nei modelli animali che nelle malattie umane, la scomparsa dei neuroni inizia alle parti distali3,4, suggerendo che i mitocondri assonali potrebbero essere più suscettibili agli insulti. Tuttavia, la biologia dei mitocondri negli assoni non è ben compresa a causa delle difficoltà associate al trattamento mirato e all’analisi dei mitocondri assonali senza disturbi simultanei dei processi del corpo cellulare.
I recenti progressi nelle tecniche di coltura di neuroni dissociati in vitro consentono ora la separazione fluidica di assoni e corpi cellulari attraverso dispositivi microfluidici5. Come illustrato nella Figura 1A, questi dispositivi sono dotati di quattro pozzetti di accesso (a/h e c/i), con due canali che collegano ogni coppia (d e f). I grandi canali sono collegati tra loro da una serie di microcanali lunghi 450 μm (e). Le differenze intenzionali nei livelli di riempimento tra le due camere creano un gradiente di pressione del fluido (Figura 1B) che impedisce la diffusione di piccole molecole dal canale con un livello di fluido inferiore all’altro lato (Figura 1C, illustrata con colorante blu Trypan).
Recentemente abbiamo utilizzato dispositivi microfluidici per studiare i requisiti di traduzione locale nella mitofagia assonale, la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati6. Nel presente protocollo, vengono presentati diversi passaggi per indurre danni mitocondriali locali attraverso il trattamento selettivo degli assoni utilizzando l’inibitore del complesso mitocondriale III Antimicina A 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive un metodo per seminare e coltivare neuroni ippocampali dissociati in un dispositivo microfluidico per trattare separatamente i mitocondri assonali. L’utilità di questo approccio con il colorante sensibile alla membrana TMRE e l’inibitore III complesso Antimicina A (come precedentemente dimostrato7) è dimostrata qui, ma questo metodo può essere facilmente adattato ad altri coloranti mitocondriali o sensori geneticamente codificati di funzioni mitocondriali che con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (HA 7728/2-1 e EXC2145 Project ID 390857198) e dalla Max Planck Society.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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