إزالة الاستقطاب الانتقائي بمساعدة الموائع الدقيقة للميتوكوندريا المحورية
Summary
يصف البروتوكول الحالي بذر وتلطيخ الميتوكوندريا العصبية في غرف الموائع الدقيقة. يسمح تدرج الضغط السائل في هذه الغرف بالمعالجة الانتقائية للميتوكوندريا في المحاور لتحليل خصائصها استجابة للتحديات الدوائية دون التأثير على حجرة جسم الخلية.
Abstract
الميتوكوندريا هي المورد الرئيسي ل ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) في الخلايا العصبية. ضعف الميتوكوندريا هو نمط ظاهري شائع في العديد من الأمراض التنكسية العصبية. بالنظر إلى البنية المعقدة لبعض المحاور العصبية وطولها الشديد، فليس من المستغرب أن تواجه الميتوكوندريا في المحاور بيئات مختلفة مقارنة بنظيراتها في جسم الخلية. ومن المثير للاهتمام ، أن خلل الميتوكوندريا المحورية غالبا ما يسبق التأثيرات على جسم الخلية. لنمذجة الخلل الوظيفي للميتوكوندريا المحورية في المختبر ، تسمح أجهزة الموائع الدقيقة بمعالجة الميتوكوندريا المحورية دون التأثير على الميتوكوندريا السومية. يمنع تدرج الضغط السائل في هذه الغرف انتشار الجزيئات ضد التدرج ، مما يسمح بتحليل خصائص الميتوكوندريا استجابة للتحديات الدوائية المحلية داخل المحاور. يصف البروتوكول الحالي بذر الخلايا العصبية الحصين المنفصلة في أجهزة الموائع الدقيقة ، وتلطيخها بصبغة حساسة ذات إمكانات غشائية ، والعلاج بسم الميتوكوندريا ، والتحليل المجهري اللاحق. يمكن تطبيق هذه الطريقة متعددة الاستخدامات لدراسة البيولوجيا المحورية على العديد من الاضطرابات الدوائية وقراءات التصوير ، وهي مناسبة للعديد من الأنواع الفرعية العصبية.
Introduction
الميتوكوندريا هي الموردين الرئيسيين ل ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) في الخلايا العصبية. نظرا لأن صحة الخلايا العصبية مرتبطة ارتباطا وثيقا بوظيفة الميتوكوندريا ، فليس من المستغرب أن يرتبط التنظيم المختل لهذه العضيات بظهور العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون1. علاوة على ذلك ، تم استخدام تسمم الميتوكوندريا بنجاح لنمذجة أعراض باركنسون في الحيوانات2. في كل من النماذج الحيوانية والأمراض البشرية ، يبدأ زوال الخلايا العصبية في الأجزاء البعيدة 3,4 ، مما يشير إلى أن الميتوكوندريا المحورية قد تكون أكثر عرضة للإهانات. ومع ذلك ، فإن بيولوجيا الميتوكوندريا في المحاور ليست مفهومة جيدا بسبب الصعوبات المرتبطة بالعلاج المستهدف وتحليل الميتوكوندريا المحورية دون اضطراب متزامن في عمليات جسم الخلية.
تسمح التطورات الحديثة في تقنيات زراعة الخلايا العصبية المنفصلة في المختبر الآن بالفصل السائل للمحاور العصبية وأجسام الخلايا من خلال أجهزة الموائع الدقيقة5. كما هو موضح في الشكل 1A ، تتميز هذه الأجهزة بأربعة آبار وصول (a / h و c / i) ، مع قناتين تربطان كل زوج (d و f). ترتبط القنوات الكبيرة ببعضها البعض بواسطة سلسلة من القنوات الدقيقة بطول 450 ميكرومتر (e). تخلق الاختلافات المتعمدة في مستويات التعبئة بين الغرفتين تدرجا لضغط السائل (الشكل 1 ب) يمنع انتشار الجزيئات الصغيرة من القناة ذات مستوى السائل المنخفض إلى الجانب الآخر (الشكل 1 ج ، موضح بصبغة تريبان الزرقاء).
استخدمنا مؤخرا أجهزة الموائع الدقيقة لدراسة متطلبات الترجمة المحلية في mitophagy المحورية ، الإزالة الانتقائية للميتوكوندرياالتالفة 6. في البروتوكول الحالي ، يتم تقديم خطوات مختلفة للحث على تلف الميتوكوندريا المحلي من خلال المعالجة الانتقائية للمحاور باستخدام مثبط مركب الميتوكوندريا III Antimycin A 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول الحالي طريقة لزرع وزراعة الخلايا العصبية الحصينية المنفصلة في جهاز الموائع الدقيقة لعلاج الميتوكوندريا المحورية بشكل منفصل. يتم توضيح فائدة هذا النهج مع الصبغة الحساسة للغشاء TMRE ومثبط المركب III Antimycin A (كما هو موضح سابقا7) هنا ، ولكن يمكن تكييف هذه الطريقة بسهول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (HA 7728 / 2-1 و EXC2145 Project ID 390857198) وجمعية ماكس بلانك.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson’s disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
