鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

すべての脊椎動物の内耳は、耳のプラコード^1,2として知られる単純な上皮に由来します。これにより、聴覚とバランスの知覚に関連する機械感覚情報を伝達するために必要なすべての構造要素と細胞型が生じます。内耳の繊毛センサーである有毛細胞(HC)は、支持細胞(SC)に囲まれています。HCは、第8脳神経のニューロンを介して聴覚後脳に情報を中継します。これらも耳プラコード³から生成される。音の一次伝達は、機械的に敏感な毛束⁴を介して、聴覚HCの頂端表面で達成される。これは、立体繊毛と呼ばれる修飾されたアクチンベースの突起を介して媒介され、それらは傾斜した階段パターン⁵に配置されています。さらに、キノシリウムと呼ばれる修飾一次繊毛は、毛束形成を組織し、ステレオ繊毛の最も高い列に隣接しています^6,7,8。ステレオ繊毛の構造は、音響エネルギーに由来する機械的刺激を電気的神経信号に変換するこの役割にとって重要です⁹。加齢、感染、耳音響外傷、または耳毒性ショックによる聴覚HCの損傷は、哺乳類では不可逆的な部分的または完全な難聴を引き起こす可能性があります¹⁰。

そのような損傷を修復する可能性のある細胞補充療法が提案されている^11,12。この研究のアプローチは、哺乳類の有毛細胞の正常な発達を理解し、内耳¹³内に存在する可能性のある前駆細胞で発生プログラムを再開できるかどうかを尋ねることでした。第2のアプローチは、哺乳類の外側、鳥類などの聴覚有毛細胞の強力な再生が起こる非哺乳類の脊椎動物に目を向けることでした^14,15。鳥類では、有毛細胞の再生は、主に支持細胞の前駆細胞様状態への脱分化、続いて非対称有糸分裂によって有毛細胞および支持細胞¹⁶を生成することによって起こる。また、有毛細胞を生成する支持細胞の直接分化も認められている¹⁷。

鳥類の聴覚発達のメカニズムは哺乳類のそれと有意な類似性を示していますが、違いがあります¹⁸。ニワトリBPにおけるHCおよびSC分化は、胚期(E)7日目から明らかになり、時間とともにより明瞭になる。E12によって、よくパターン化され、よく分極された脳底乳頭(BP)を視覚化することができ、E17によって、よく発達した有毛細胞を見ることができます¹⁹。これらの時点は、分化、パターン形成、極性、および有毛細胞の成熟のメカニズムへの窓を提供します。このようなメカニズムが保存されているか分岐しているかを理解することは、機械感覚有毛細胞の起源の深い相同性への洞察を提供するため、重要です。

ここでは、内耳器官の発達全体にわたる増殖、運命の特定、分化、パターン形成、維持などの細胞プロセスを研究するために、初期および後期の胚期に実行される一連の技術を示します。これは、外植片培養における内耳の発達を理解するための他のプロトコルを補完する^{ものです20,21,22}。まず、Ovoエレクトロポレーションを用いてE3.5耳嚢胞内のBP前駆体に外因性DNAまたはRNAを導入する方法について説明します。遺伝子操作は貴重な洞察を提供することができますが、このようにして生成された表現型は多面的であり、その結果、交絡する可能性があります。これは、細胞骨格リモデリングなどの基本的なプロセスが細胞分裂、組織形態形成、および細胞の特殊化において複数の役割を果たす後期の内耳発達に特に当てはまります。本研究では、外植体培養における薬理阻害のプロトコールを提示し、投与量や治療のタイミングや期間の制御に利点をもたらし、発生機構の正確な時空間操作を提供します。

小さな阻害剤の処理期間に応じて、さまざまな臓器培養方法を利用できます。ここでは、上皮の形態形成と細胞の特殊化に関する洞察を可能にする2つの臓器培養方法を示します。コラーゲンをマトリックスとして蝸牛管を培養する3D培養法は、発達中のBPの堅牢な培養とライブ可視化を可能にします。ステレオ繊毛の形成を理解するために、硬いマトリックス上で上皮組織を培養し、アクチン突起を自由に成長させる膜培養法を紹介します。どちらの方法でも、ライブセルイメージング、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡(SEM)、細胞記録などのダウンストリーム処理が可能です。これらの技術は、鳥類の聴覚上皮の発生、成熟、再生を理解および操作するためのモデルシステムとしてひよこを効果的に使用するためのロードマップを提供します。