In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

A orelha interna de todos os vertebrados é derivada de um epitélio simples conhecido como placode ótico ^1,2. Isso dará origem a todos os elementos estruturais e aos tipos de células necessários para transduzir a informação mecanossensorial associada à audição e à percepção de equilíbrio. As células ciliadas (HCs), o sensor ciliado do ouvido interno, são cercadas por células de suporte (SCs). Os HCs transmitem informações para o rombencéfalo auditivo através dos neurônios do oitavo nervo craniano. Estes também são gerados a partir do placode ótico³. A transdução primária do som é realizada na superfície apical do HC auditivo, através de um feixe capilar mecanicamente sensível⁴. Isso é mediado por meio de saliências modificadas à base de actina chamadas estereocílios, que são dispostas em um padrão de escada graduada⁵. Além disso, um cílio primário modificado, chamado de cinocílio, organiza a formação de feixes capilares e é adjacente à fileira mais alta de estereocílios ^6,7,8. A arquitetura dos estereocílios é fundamental para esse papel na conversão de estímulos mecânicos derivados da energia acústica em sinais neurais elétricos⁹. Danos à HC auditiva por envelhecimento, infecção, trauma otoacústico ou choque ototóxico podem resultar em perda auditiva parcial ou completa que, em mamíferos, é irreversível¹⁰.

Terapias de substituição celular têm sido propostas que podem reparar tais danos^11,12. A abordagem desta pesquisa tem sido compreender o desenvolvimento normal da célula ciliada de mamíferos e perguntar se os programas de desenvolvimento podem ser reiniciados em células semelhantes a progenitores que possam existir dentro da orelha interna¹³. Uma segunda abordagem tem sido olhar para fora dos mamíferos, para vertebrados não mamíferos nos quais ocorre regeneração robusta das células ciliadas auditivas, como as aves^14,15. Em aves, a regeneração das células ciliadas ocorre predominantemente através da desdiferenciação de uma célula de suporte para um estado semelhante ao de progenitor, seguida de divisão mitótica assimétrica para gerar uma célula ciliada e uma célula de suporte¹⁶. Além disso, a diferenciação direta de uma célula de suporte para gerar uma célula ciliada também tem sido observada¹⁷.

Embora os mecanismos de desenvolvimento auditivo aviário mostrem semelhanças significativas com os dos mamíferos, existem diferenças¹⁸. A diferenciação de HC e SC na PA do pintinho é aparente a partir do dia embrionário (E) 7, tornando-se mais distinta ao longo do tempo. Por E12, uma papila basilar (PA) bem padronizada e bem polarizada pode ser visualizada, e por E17 células ciliadas bem desenvolvidas podem ser vistas¹⁹. Esses pontos de tempo fornecem janelas para os mecanismos de diferenciação, padronização e polaridade, bem como a maturação das células ciliadas. Entender se tais mecanismos são conservados ou divergentes é importante, pois eles fornecem insights sobre a homologia profunda das origens das células ciliadas mecanossensoriais.

Aqui, demonstramos uma série de técnicas realizadas em estágios embrionários iniciais e tardios para estudar processos celulares, como proliferação, especificação de destino, diferenciação, padronização e manutenção ao longo do desenvolvimento do órgão do ouvido interno. Isso complementa outros protocolos de compreensão do desenvolvimento da orelha interna em cultura de explante^20,21,22. Primeiro, discutimos a introdução de DNA ou RNA exógeno em precursores da PA dentro do otocisto E3.5 usando na ovo-eletroporação. Embora as manipulações genéticas possam fornecer informações valiosas, os fenótipos assim gerados podem ser pleiotrópicos e, consequentemente, confusos. Isto é particularmente verdadeiro durante o desenvolvimento posterior do ouvido interno, onde processos fundamentais, como o remodelamento citoesquelético, desempenham múltiplos papéis na divisão celular, morfogênese tecidual e especialização celular. Apresentamos protocolos de inibição farmacológica em explantes cultivados, que oferecem vantagens no controle da dosagem e do tempo e duração do tratamento, oferecendo manipulação espaço-temporal precisa dos mecanismos de desenvolvimento.

Diferentes métodos de cultura de órgãos podem ser utilizados, dependendo da duração do tratamento de pequenos inibidores. Aqui demonstramos dois métodos de cultura de órgãos que permitem insights sobre a morfogênese epitelial e a especialização celular. Um método para cultura 3D usando colágeno como matriz para cultivar o ducto coclear permite a cultura robusta e a visualização ao vivo da PA em desenvolvimento. Para a compreensão da formação de estereocílios, apresentamos um método de cultura de membrana de tal forma que o tecido epitelial seja cultivado em uma matriz rígida, permitindo que as saliências de actina cresçam livremente. Ambos os métodos permitem o processamento a jusante, como imagens de células vivas, imuno-histoquímica, microscopia eletrônica de varredura (MEV), gravação celular, etc. Essas técnicas fornecem um roteiro para o uso efetivo do pintinho como um sistema modelo para entender e manipular o desenvolvimento, maturação e regeneração do epitélio auditivo aviário.