בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות
Summary
הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.
Abstract
האוזן הפנימית קולטת צלילים ושומרת על איזון באמצעות השבלול והפרוזדור. הוא עושה זאת על ידי שימוש בסוג תא מכניו-חושי ייעודי המכונה תא השערה. מחקר בסיסי באוזן הפנימית הוביל להבנה עמוקה של האופן שבו תאי השערה מתפקדים, וכיצד חוסר ויסות יכול להוביל לליקוי שמיעה ולסחרחורת. לצורך מחקר זה, העכבר היה מערכת המודל הבולטת ביותר. עם זאת, עכברים, כמו כל היונקים, איבדו את היכולת להחליף תאי שערה. לכן, כאשר מנסים להבין טיפולים תאיים לשיקום תפקוד האוזן הפנימית, מחקרים משלימים במינים אחרים של בעלי חוליות יכולים לספק תובנות נוספות. האפיתל השמיעתי של ציפורים, הפפילה הבזילרית (BP), הוא יריעה של אפיתל המורכבת מתאי שערה מכנו-חושיים (HCs) המשולבים על ידי תאים תומכים (SCs). למרות שהארכיטקטורה האנטומית של הפפילה הבזילרית והשבלול של היונקים שונה, המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית והשמיעה דומים. זה הופך את הפפילה הבזילרית למערכת שימושית לא רק למחקרים השוואתיים אלא גם להבנת התחדשות. כאן נתאר טכניקות דיסקציה ומניפולציה לאוזן הפנימית של התרנגולת. הטכניקה מציגה שיטות עיכוב גנטיות ומולקולות קטנות, המציעות כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית. במאמר זה, אנו דנים בטכניקות אלקטרופורציה של ovo כדי להפריע גנטית לפפילה הבזילרית באמצעות מחיקות CRIPSR-Cas9, ולאחר מכן דיסקציה של הפפילה הבזילית. אנו גם מדגימים את תרבית איברי BP ושימוש אופטימלי במטריצות תרבית, כדי לבחון את התפתחות האפיתל ותאי השערה.
Introduction
האוזן הפנימית של כל בעלי החוליות נגזרת מאפיתל פשוט המכונה placodeotic 1,2. זה יוליד את כל האלמנטים המבניים ואת סוגי התאים הדרושים כדי להמיר את המידע mechanosensory הקשורים שמיעה ותפיסת שיווי משקל. תאי השערה (HCs), החיישן הציליאטי של האוזן הפנימית, מוקפים בתאים תומכים (SCs). HCs מעבירים מידע למוח האחורי השמיעתי דרך הנוירונים של עצב הגולגולת השמיני. אלה נוצרים גם מן placode otic3. ההתמרה הראשונית של הצליל מושגת על פני השטח האפיקליים של HC השמיעתי, באמצעות צרור שיער רגיש מכנית4. זה מתווך באמצעות בליטות מבוססות אקטין מותאמות הנקראות סטריאוציליה, המסודרות בתבנית מדרגות מדורגת5. בנוסף, cilium ראשוני שונה, הנקרא kinocilium, מארגן היווצרות צרור שיער והוא צמוד לשורה הגבוהה ביותר של סטריאוציליה 6,7,8. הארכיטקטורה של סטריאוציליה היא קריטית לתפקיד זה בהמרת גירויים מכניים הנגזרים מאנרגיה אקוסטית לאותות עצביים חשמליים9. נזק ל-HC השמיעתי כתוצאה מהזדקנות, זיהום, טראומה אוטואקוסטית או הלם אוטוטוקסי עלול לגרום לליקוי שמיעה חלקי או מלא, שביונקים הוא בלתי הפיך10.
הוצעו טיפולים תחליפיים תאיים שעשויים לתקן נזק כזה11,12. הגישה של מחקר זה הייתה להבין את ההתפתחות התקינה של תאי השערה של יונקים ולשאול אם ניתן להתחיל מחדש תוכניות התפתחות בתאים דמויי אב שעשויים להתקיים בתוך האוזן הפנימית13. גישה שנייה הייתה להסתכל מחוץ ליונקים, אל בעלי חוליות שאינם יונקים שבהם מתרחשת התחדשות חזקה של תאי שערה שמיעתיים, כגון ציפורים14,15. אצל ציפורים, התחדשות תאי השערה מתרחשת בעיקר באמצעות דה-דיפרנציאציה של תא תומך למצב דמוי אב, ולאחר מכן חלוקה מיטוטית אסימטרית ליצירת תא שערה ותאתומך 16. בנוסף, הבחנה ישירה של תא תומך ליצירת תא שערה נצפתה גם17.
בעוד שהמנגנונים של התפתחות שמיעת העופות מראים דמיון משמעותי לזה של יונקים, ישנם הבדלים18. התמיינות HC ו-SC באפרוח BP ניכרת מיום עוברי (E) 7, והופכת מובחנת יותר עם הזמן. על ידי E12, ניתן לדמיין פפילה בזילרית (BP) מעוצבת ומקוטבת היטב, ועל ידי E17 ניתן לראות תאי שיער מפותחים היטב19. נקודות זמן אלה מספקות חלונות למנגנונים של התמיינות, דפוס וקוטביות, כמו גם התבגרות תאי שערה. ההבנה אם מנגנונים כאלה נשמרים או מסתעפים היא חשובה, שכן הם מספקים תובנות על ההומולוגיה העמוקה של מקורות תאי השערה המכנו-חושיים.
כאן אנו מדגימים מגוון טכניקות המבוצעות בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחרים כדי לחקור תהליכים תאיים כגון התפשטות, אפיון גורל, התמיינות בתבניות ותחזוקה לאורך התפתחות איבר האוזן הפנימית. זה משלים פרוטוקולים אחרים על הבנת התפתחות האוזן הפנימית בתרבית explant20,21,22. תחילה נדון בהחדרת דנ”א אקסוגני או רנ”א למבשרי BP בתוך האוטוציסט E3.5 באמצעות אלקטרופורציה של ovo. למרות שמניפולציות גנטיות יכולות לספק תובנות חשובות, הפנוטיפים שנוצרו כך יכולים להיות פליאוטרופיים וכתוצאה מכך מבלבלים. זה נכון במיוחד במהלך התפתחות מאוחרת יותר של האוזן הפנימית, שבה תהליכים בסיסיים כגון שיפוץ ציטוסקטלי ממלאים תפקידים רבים בחלוקת תאים, מורפוגנזה של רקמות והתמחות תאית. אנו מציגים פרוטוקולים לעיכוב פרמקולוגי במרגלים מתורבתים, המציעים יתרונות בשליטה על תזמון ומשך הטיפול והטיפול, ומציעים מניפולציה מרחבית-טמפורלית מדויקת של מנגנוני התפתחות.
ניתן להשתמש בשיטות שונות של תרבית איברים בהתאם למשך הטיפול במעכבים קטנים. כאן אנו מדגימים שתי שיטות של תרבית איברים המאפשרות תובנות על מורפוגנזה אפיתליאלית והתמחות תאית. שיטה לתרבית תלת-ממדית המשתמשת בקולגן כמטריצה לתרבית צינור השבלול מאפשרת התרבות החזקה והדמיה חיה של ה-BP המתפתח. להבנת היווצרות הסטריאוציליה, אנו מציגים שיטת תרבית ממברנה כך שרקמת האפיתל עוברת בתרבית על מטריצה נוקשה המאפשרת לבליטות אקטין לגדול בחופשיות. שתי השיטות מאפשרות עיבוד במורד הזרם כגון הדמיית תאים חיים, אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM), הקלטת תאים וכו ‘. טכניקות אלה מספקות מפת דרכים לשימוש יעיל בגוזל כמערכת מודל להבנה ולמניפולציה של ההתפתחות, ההבשלה וההתחדשות של אפיתל השמיעה של העופות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגוזל הוא תוספת חסכונית ונוחה לאורגניזמי המודל שמעבדה עשויה להשתמש בהם כדי לחקור את האוזן הפנימית. השיטות המתוארות כאן משמשות באופן שגרתי במעבדה שלנו ומשלימות מחקר מתמשך באוזן הפנימית של היונקים. ב ovo אלקטרופורציה משמש כדי להציג מניפולציות גנטיות לתוך הגנום אפרוח. אלקטרופורציה יכול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על תמיכה מ-NCBS, TIFR, מענק מחקר מוביל של Infosys-TIFR, DST-SERB והמכון הלאומי המלכותי לחירשים. ברצוננו להודות לארגון פיתוח עופות מרכזי ומכון הכשרה, Hesaraghatta, בנגלור. אנו אסירי תודה לתמיכת המתקן והמעבדה של CIFF ו- EM ב- NCBS. אנו מודים ליושיקו טקהאשי וקויצ’י קוואקאמי על בניית Tol2-eGFP ו- T2TP, ולגיא ריצ’רדסון על נוגדן HCA ו- G19 Pcdh15. אנו מודים לחברי ארלאב על תמיכתם המתמדת והמשוב החשוב שלהם על הפרוטוקול.
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O’Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
