Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

L’oreille interne de tous les vertébrés est dérivée d’un épithélium simple connu sous le nom de placode otique ^1,2. Cela donnera naissance à tous les éléments structurels et aux types de cellules nécessaires pour transduire les informations mécanosensorielles associées à la perception de l’audition et de l’équilibre. Les cellules ciliées (HC), le capteur cilié de l’oreille interne, sont entourées de cellules de soutien (SC). Les HC transmettent l’information au cerveau postérieur auditif par l’intermédiaire des neurones du huitième nerf crânien. Ceux-ci sont également générés à partir du placode otique³. La transduction primaire du son est réalisée à la surface apicale du HC auditif, à travers un faisceau pileux mécaniquement sensible⁴. Ceci est médié par des protubérances modifiées à base d’actine appelées stéréocils, qui sont disposées dans un modèle d’escalier gradué⁵. De plus, un cil primaire modifié, appelé kinocilium, organise la formation de faisceaux de cheveux et est adjacent à la plus haute rangée de stéréocils ^6,7,8. L’architecture des stéréocils est essentielle pour ce rôle dans la conversion des stimuli mécaniques dérivés de l’énergie acoustique en signaux neuronaux électriques⁹. Les dommages causés au HC auditif par le vieillissement, une infection, un traumatisme otoacoustique ou un choc ototoxique peuvent entraîner une perte auditive partielle ou complète qui, chez les mammifères, est irréversible¹⁰.

Des thérapies de remplacement cellulaire ont été proposées qui pourraient réparer ces dommages^11,12. L’approche de cette recherche a été de comprendre le développement normal de la cellule ciliée des mammifères et de se demander si les programmes de développement peuvent être réinitiés dans les cellules de type progéniteur qui peuvent exister dans l’oreille interne¹³. Une deuxième approche a consisté à regarder en dehors des mammifères, vers les vertébrés non mammifères chez lesquels une régénération robuste des cellules ciliées auditives a lieu, comme les oiseaux^14,15. Chez les oiseaux, la régénération des cellules ciliées se produit principalement par la dédifférenciation d’une cellule de soutien à un état de progéniteur, suivie d’une division mitotique asymétrique pour générer une cellule ciliée et une cellule de soutien¹⁶. De plus, une différenciation directe d’une cellule de soutien pour générer une cellule ciliée a également été observée¹⁷.

Bien que les mécanismes du développement auditif aviaire présentent des similitudes significatives avec celui des mammifères, il existe des différences¹⁸. La différenciation HC et SC chez le poussin BP est apparente dès le jour embryonnaire (E) 7, devenant plus nette au fil du temps. Par E12, une papille basilaire (BP) bien structurée et bien polarisée peut être visualisée, et par E17, des cellules ciliées bien développées peuvent être vues¹⁹. Ces points temporels fournissent des fenêtres sur les mécanismes de différenciation, de modelage et de polarité, ainsi que sur la maturation des cellules ciliées. Il est important de comprendre si de tels mécanismes sont conservés ou divergents, car ils permettent de mieux comprendre l’homologie profonde des origines des cellules ciliées mécanosensorielles.

Ici, nous démontrons un éventail de techniques effectuées aux stades embryonnaires précoces et tardifs pour étudier les processus cellulaires tels que la prolifération, la spécification du destin, la différenciation, la structuration et le maintien tout au long du développement de l’organe de l’oreille interne. Cela complète d’autres protocoles sur la compréhension du développement de l’oreille interne dans la culture explant^20,21,22. Nous discutons d’abord de l’introduction d’ADN ou d’ARN exogène dans les précurseurs de la PA dans l’otocyste E3.5 en utilisant l’électroporation in ovo. Bien que les manipulations génétiques puissent fournir des informations précieuses, les phénotypes ainsi générés peuvent être pléiotropes et par conséquent confondants. Cela est particulièrement vrai au cours du développement ultérieur de l’oreille interne, où des processus fondamentaux tels que le remodelage cytosquelettique jouent de multiples rôles dans la division cellulaire, la morphogenèse tissulaire et la spécialisation cellulaire. Nous présentons des protocoles d’inhibition pharmacologique dans les explants cultivés, qui offrent des avantages dans le contrôle de la posologie et du moment et de la durée du traitement, offrant une manipulation spatio-temporelle précise des mécanismes de développement.

Différentes méthodes de culture d’organes peuvent être utilisées en fonction de la durée du traitement des petits inhibiteurs. Nous démontrons ici deux méthodes de culture d’organes qui permettent de mieux comprendre la morphogenèse épithéliale et la spécialisation cellulaire. Une méthode de culture 3D utilisant le collagène comme matrice pour cultiver le canal cochléaire permet une culture robuste et une visualisation en direct de la PA en développement. Pour comprendre la formation des stéréocils, nous présentons une méthode de culture membranaire telle que le tissu épithélial est cultivé sur une matrice rigide permettant aux protubérances d’actine de se développer librement. Les deux méthodes permettent un traitement en aval tel que l’imagerie de cellules vivantes, l’immunohistochimie, la microscopie électronique à balayage (MEB), l’enregistrement cellulaire, etc. Ces techniques fournissent une feuille de route pour l’utilisation efficace du poussin comme système modèle pour comprendre et manipuler le développement, la maturation et la régénération de l’épithélium auditif aviaire.