In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Het binnenoor van alle gewervelde dieren is afgeleid van een eenvoudig epitheel dat bekend staat als de otic placode ^1,2. Dit zal aanleiding geven tot alle structurele elementen en de celtypen die nodig zijn om de mechanosensorische informatie in verband met gehoor- en evenwichtsperceptie te transduceren. Haarcellen (HCs), de trilhaarsensor van het binnenoor, zijn omgeven door ondersteunende cellen (SC’s). HC’s geven informatie door aan de auditieve achterhersenen via de neuronen van de achtste hersenzenuw. Deze worden ook gegenereerd uit de otic placode³. De primaire transductie van geluid wordt bereikt aan het apicale oppervlak van de auditieve HC, door een mechanisch gevoelige haarbundel⁴. Dit wordt gemedieerd door gemodificeerde op actine gebaseerde uitsteeksels genaamd stereocilia, die zijn gerangschikt in een gradueel trappatroon⁵. Bovendien organiseert een gemodificeerd primair cilium, het kinocilium genaamd, de vorming van haarbundels en grenst het aan de hoogste rij stereocilia ^6,7,8. De architectuur van stereocilia is van cruciaal belang voor deze rol bij het omzetten van mechanische stimuli afgeleid van akoestische energie naar elektrische neurale signalen⁹. Schade aan de auditieve HC door veroudering, infectie, otoakoestisch trauma of ototoxische shock kan leiden tot gedeeltelijk of volledig gehoorverlies dat bij zoogdieren onomkeerbaar is¹⁰.

Cellulaire vervangingstherapieën zijn voorgesteld die dergelijke schade kunnen herstellen^11,12. De benadering van dit onderzoek is geweest om de normale ontwikkeling van de haarcel van zoogdieren te begrijpen en te vragen of ontwikkelingsprogramma’s opnieuw kunnen worden geïnitieerd in voorloperachtige cellen die mogelijk in het binnenoor bestaan¹³. Een tweede benadering is geweest om buiten zoogdieren te kijken, naar niet-zoogdier gewervelde dieren waarbij robuuste regeneratie van auditieve haarcellen plaatsvindt, zoals vogels^14,15. Bij vogels vindt haarcelregeneratie voornamelijk plaats door de dedifferentiatie van een ondersteunende cel naar een voorloperachtige toestand, gevolgd door asymmetrische mitotische deling om een haarcel en ondersteunende cel¹⁶ te genereren. Daarnaast is ook directe differentiatie van een ondersteunende cel waargenomen om een haarcel te genereren¹⁷.

Hoewel de mechanismen van de auditieve ontwikkeling van vogels significante overeenkomsten vertonen met die van zoogdieren, zijn er verschillen¹⁸. HC- en SC-differentiatie in het kuiken BP is duidelijk vanaf embryonale dag (E) 7 en wordt in de loop van de tijd duidelijker. Door E12 kan een goed gevormde en goed gepolariseerde basilaire papilla (BP) worden gevisualiseerd, en door E17 kunnen goed ontwikkelde haarcellen worden gezien¹⁹. Deze tijdspunten bieden vensters op de mechanismen van differentiatie, patronen en polariteit, evenals haarcelrijping. Begrijpen of dergelijke mechanismen geconserveerd of divergent zijn, is belangrijk, omdat ze inzicht geven in de diepe homologie van de oorsprong van mechanosensorische haarcellen.

Hier demonstreren we een reeks technieken die in vroege en late embryonale stadia worden uitgevoerd om cellulaire processen te bestuderen, zoals proliferatie, lotspecificatie, differentiatie, patronen en onderhoud tijdens de ontwikkeling van het binnenoororgaan. Dit is een aanvulling op andere protocollen voor het begrijpen van de ontwikkeling van het binnenoor in explantcultuur 20,21,22. We bespreken eerst de introductie van exogene DNA of RNA in BP-precursoren binnen de E3.5-otocyste met behulp van ovo-elektroporatie. Hoewel genetische manipulaties waardevolle inzichten kunnen opleveren, kunnen de aldus gegenereerde fenotypen pleiotroop en bijgevolg verwarrend zijn. Dit geldt met name tijdens de latere ontwikkeling van het binnenoor, waar fundamentele processen zoals cytoskeletale remodellering meerdere rollen spelen bij celdeling, weefselmorfogenese en cellulaire specialisatie. We presenteren protocollen voor farmacologische remming in gekweekte explantaten, die voordelen bieden bij het beheersen van de dosering en de timing en duur van de behandeling, en die nauwkeurige spatiotemporale manipulatie van ontwikkelingsmechanismen bieden.

Verschillende orgaankweekmethoden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de behandelingsduur van kleine remmers. Hier demonstreren we twee methoden van orgaancultuur die inzicht geven in epitheliale morfogenese en cellulaire specialisatie. Een methode voor 3D-cultuur met collageen als matrix om het cochleaire kanaal te kweken, maakt robuuste kweek en live visualisatie van de zich ontwikkelende BP mogelijk. Om de vorming van stereocilia te begrijpen, presenteren we een membraankweekmethode, zodat epitheelweefsel wordt gekweekt op een stijve matrix waardoor actine-uitsteeksels vrij kunnen groeien. Beide methoden maken downstream-verwerking mogelijk, zoals live-cell imaging, immunohistochemie, scanning elektronenmicroscopie (SEM), celregistratie, enz. Deze technieken bieden een routekaart voor het effectieve gebruik van het kuiken als een modelsysteem om de ontwikkeling, rijping en regeneratie van het auditieve epitheel van de aviaire te begrijpen en te manipuleren.