В методах Ovo и Ex Ovo для изучения развития внутреннего уха птиц

Внутреннее ухо всех позвоночных получено из простого эпителия, известного как отический плакод ^1,2. Это приведет к появлению всех структурных элементов и типов клеток, необходимых для передачи механосенсорной информации, связанной со слухом и восприятием равновесия. Волосковые клетки (ГК), реснитчатый датчик внутреннего уха, окружены поддерживающими клетками (СК). ГК передают информацию слуховому заднему мозгу через нейроны восьмого черепного нерва. Они также генерируются из otic placode³. Первичная трансдукция звука достигается на апикальной поверхности слухового HC, через механически чувствительный пучок волос⁴. Это опосредовано через модифицированные протрузии на основе актина, называемые стереоцилиями, которые расположены в градуированном лестничном шаблоне⁵. Кроме того, модифицированная первичная ресничка, называемая киноцилиумом, организует образование пучков волос и примыкает к самому высокому ряду стереоцилий ^6,7,8. Архитектура стереоцилий имеет решающее значение для этой роли в преобразовании механических стимулов, полученных из акустической энергии, в электрические нейронные сигналы⁹. Повреждение слухового HC в результате старения, инфекции, отоакустической травмы или ототоксического шока может привести к частичной или полной потере слуха, которая у млекопитающих необратима¹⁰.

Была предложена клеточная заместительная терапия, которая может восстановить такое повреждение^11,12. Подход этого исследования заключался в том, чтобы понять нормальное развитие волосковых клеток млекопитающих и спросить, могут ли программы развития быть восстановлены в клетках-предшественниках, которые могут существовать во внутреннем ухе¹³. Второй подход заключался в том, чтобы смотреть за пределы млекопитающих, на позвоночных, не являющихся млекопитающими, у которых происходит надежная регенерация слуховых волосковых клеток, таких как птицы^14,15. У птиц регенерация волосковых клеток происходит преимущественно путем дедифференцировки поддерживающей клетки до состояния, подобного предшественнику, с последующим асимметричным митотическим делением для генерации волосковой клетки и поддерживающей клетки¹⁶. Кроме того, также наблюдалась прямая дифференцировка поддерживающей клетки для генерации волосковой^{клетки 17}.

В то время как механизмы развития слуха птиц действительно показывают значительное сходство с механизмами развития млекопитающих, существуют различия¹⁸. Дифференциация HC и SC у цыплят АД проявляется с эмбрионального дня (E) 7, становясь более отчетливой с течением времени. По E12 можно визуализировать хорошо структурированный и хорошо поляризованный базилярный сосочек (АД), а по E17 хорошо развитые волосковые клетки можно увидеть¹⁹. Эти временные точки обеспечивают окна в механизмы дифференцировки, паттерна и полярности, а также созревания волосковых клеток. Понимание того, сохраняются ли такие механизмы или расходятся, важно, поскольку они дают представление о глубокой гомологии происхождения механосенсорных волосковых клеток.

Здесь мы демонстрируем множество методов, выполняемых на ранних и поздних эмбриональных стадиях для изучения клеточных процессов, таких как пролиферация, спецификация судьбы, дифференциация, паттерн и поддержание на протяжении всего развития органа внутреннего уха. Это дополняет другие протоколы по пониманию развития внутреннего уха в культуре экспланта 20,21,22. Сначала мы обсудим введение экзогенной ДНК или РНК в предшественники АД в отоцисте Е3,5 с использованием в электропорации ово. Хотя генетические манипуляции могут дать ценную информацию, фенотипы, генерируемые таким образом, могут быть плейотропными и, следовательно, смешивать. Это особенно верно во время более позднего развития внутреннего уха, где фундаментальные процессы, такие как ретоскелетное ремоделирование, играют множество ролей в делении клеток, морфогенезе тканей и клеточной специализации. Мы представляем протоколы фармакологического ингибирования в культивируемых эксплантатах, которые предлагают преимущества в контроле дозировки, сроков и продолжительности лечения, предлагая точные пространственно-временные манипуляции с механизмами развития.

Различные методы культивирования органов могут быть использованы в зависимости от продолжительности лечения небольшими ингибиторами. Здесь мы демонстрируем два метода культуры органов, которые позволяют понять эпителиальный морфогенез и клеточную специализацию. Метод 3D-культуры с использованием коллагена в качестве матрицы для культивирования кохлеарного протока обеспечивает надежное культивирование и живую визуализацию развивающегося АД. Для понимания формирования стереоцилий мы представляем метод мембранной культуры, такой, что эпителиальная ткань культивируется на жесткой матрице, позволяющей актиновым протрузиям свободно расти. Оба метода позволяют проводить последующую обработку, такую как визуализация живых клеток, иммуногистохимия, сканирующая электронная микроскопия (SEM), запись клеток и т. Д. Эти методы обеспечивают дорожную карту для эффективного использования цыпленка в качестве модельной системы для понимания и манипулирования развитием, созреванием и регенерацией слухового эпителия птицы.