Traitement médicamenteux par cathéter veineux central dans un modèle murin d’anévrisme de l’aorte abdominale induit par l’angiotensine II et surveillance par échographie 3D

Les expérimentations sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique local et le ministère autrichien des Sciences (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), conformément à la directive européenne 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et à la loi autrichienne de 2012 sur l’expérimentation animale. Les critères d’évaluation sans cruauté ont été fixés comme suit : perte de ≥15 % du poids corporel, éviter la consommation de nourriture et/ou d’eau, activité réduite (hypokinésie) ou dyskinésie, ou tremblements prolongés, grattage, respiration laborieuse ou posture voûtée malgré la gestion de la douleur et des symptômes. Si nécessaire, un animal est euthanasié sous anesthésie profonde, c’est-à-dire un cocktail de surdosage de kétamine (environ 100 mg/kg) et de xylazine (environ 5 mg/kg), ou par luxation cervicale. Pour les interventions chirurgicales, une technique aseptique et des gants stériles / propres sont utilisés partout. 1. Implantation de pompe AnesthésieMaintenir les souris déficientes en ApoE (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) avec un régime alimentaire normal et inclure de préférence des animaux mâles âgés de 12 à 14 semaines dans les expériences pour représenter la prédominance masculine dans la maladie humaine3. 1 jour avant la chirurgie (j-1, pré-OP), préparer et remplir les pompes osmotiques avec la concentration souhaitée d’angiotensine II en fonction du poids de la souris en suivant le protocole du fabricant et incuber les pompes dans une solution saline à 37 °C pendant la nuit15.Exemple : Pour une souris de 25 g, à l’aide de pompes osmotiques (voir le tableau des matériaux) avec un débit de 1000 ng/kg/min et un débit de pompe de 0,25 μL/h pendant 28 jours, dissoudre 1,8 mg d’Ang-II dans 300 μL de solution saline (concentration de 6000 ng/μL pour délivrer 1500 ng/h d’Ang-II). Chargez la solution avec l’aiguille de remplissage émoussée dans la pompe, puis insérez le modérateur de débit pour fermer la pompe. Placez la souris dans la chambre d’anesthésie à 3%-4% d’isoflurane mélangé avec 2 L/minO2 jusqu’à ce qu’elle perde connaissance. Déplacez la souris sur une table chauffée (37 °C) en position couchée sur le ventre et maintenez l’anesthésie à l’isoflurane à 1,8%-2% par un cône nasal. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Injectez à la souris 2,5% de buprénorphine dans une solution saline à 10 μL / g de souris par voie sous-cutanée et vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement d’orteil. Rasez une petite zone sur le côté supérieur gauche de la souris au-dessus de l’omoplate. Appliquer une solution de povidone iodée à 10 % (p/v) pour désinfecter la zone rasée. Insertion de la pompe (5-7 min, réalisée sans microscope)Vérifiez que la souris est complètement anesthésiée par pincement des orteils et faites une incision transversale de 1 cm dans la peau du haut du dos avec un scalpel entre la ligne scapulaire médiane et gauche. Tenez la peau avec une pince et utilisez des ciseaux émoussés et incurvés pour créer une poche sous-cutanée en poussant vers le membre postérieur gauche. Ouvrez les ciseaux, retirez les ciseaux ouverts de la coupe et répétez pour élargir la poche. Insérez doucement la pompe dans la poche avec le modérateur de débit vers la queue (pour minimiser l’interférence potentielle de la libération d’Ang-II par le site d’incision).REMARQUE: La poche doit non seulement être assez large pour l’insertion de la pompe, mais aussi pour que la peau ne soit pas serrée autour de la pompe, et il doit y avoir au moins 5 mm entre la pompe et le site d’incision pour permettre une cicatrisation optimale de la plaie. Fermez la plaie avec des sutures interrompues résorbables 4-0. Injectez à la souris 10% de glucose dans une solution saline à 10 μL / g de souris par voie sous-cutanée. Appliquez un vaporisateur de povidone iodée sur la plaie fermée et laissez la souris reprendre conscience sous une lampe chauffante, puis remettez-la dans la cage avec 7,5 mg de piritramide (pour une gestion prolongée de la douleur) et 20 ml de glucose à 5% dans 200 ml d’eau potable pendant 3 jours après l’opération. Vérifiez les souris plusieurs fois par jour pour des signes de douleur ou de détresse.REMARQUE : Étant donné que les ruptures aortiques se produisent à un taux de 20 % à 40 % et principalement dans les 3 à 10 premiers jours suivant l’opération, le risque de douleur ou de détresse intense prolongée doit être minimisé par une surveillance fréquente des animaux. Les principaux signes de rupture imminente sont : séparation du groupe, posture voûtée, diminution de la mobilité (jusqu’à la paralysie des membres postérieurs) et diminution ou absence de réponse lors de la manipulation. 2. Cathétérisme de la veine jugulaire REMARQUE: Cette intervention chirurgicale nécessite un microscope avec un grossissement de 8x-10x. À l’aide du système d’accès vasculaire (voir Tableau des matériaux), préparer le cathéter en coupant le côté 3Fr à la longueur désirée (~5-7 mm avant l’ancrage en silicone) et en poussant le cathéter sur le connecteur métallique 22 G du système d’accès vasculaire (SAV) avec un chevauchement d’au moins 3 mm. Placez le capuchon en aluminium sur le bouton pour protéger le port. Préparez des ligatures de soie 6-0 de 1-1,5 cm de long. Placez la souris dans la chambre d’anesthésie à 3%-4% d’isoflurane mélangé avec 2 L/minO2 jusqu’à ce qu’elle perde connaissance. Déplacez la souris vers une table chauffée (37 °C) en décubitus dorsal et maintenez l’anesthésie à l’isoflurane à 1,8%-2% par un cône nasal. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Injecter à la souris 2,5% de buprénorphine dans une solution saline à 10 μL / g de souris par voie sous-cutanée. Rasez la fourrure du côté droit du cou sur le côté ventral et sur le côté droit du haut du dos (le côté gauche aura la pompe osmotique implantée). Appliquez la solution povidone-iode pour désinfecter la zone rasée. Vérifiez que la souris est complètement anesthésiée par pincement des orteils. Préparation de la veine jugulaire (5-10 min, réalisée au microscope)Faites une incision cutanée supraclaviculaire transversale de 0,5 cm sur le côté droit du cou sur la clavicule droite. Utilisez une pince à épiler microchirurgicale émoussée pour séparer le tissu conjonctif et la graisse, exposant ainsi la veine jugulaire externe. Évitez de déchirer les petits vaisseaux sanguins dans la graisse. Isoler au moins 5 mm du vaisseau, près des muscles pectoraux. Disséquer le tissu contondant sous la veine à l’aide de micro-pincettes pliées et passer à travers 2-3 des ligatures 6-0.REMARQUE: Si des branches latérales sont identifiées dans la zone d’intérêt, soit la ligature doit être insérée pour être caudale à la branche latérale, soit la branche latérale doit être ligaturée de façon permanente en isolant et en attachant avec une ligature 6-0. Rentrez les ligatures et ajoutez une goutte de solution saline au site. Implantation de boutons (5-7 min, réalisée sans microscope)Retournez la souris et placez-la en position couchée; Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement d’orteil et appliquez la solution de povidone iodée pour désinfecter la zone rasée. Faites une incision sagittale de 1 cm sur le haut du dos avec un scalpel entre les lignes scapulaires médiane et droite. Utilisez des ciseaux incurvés émoussés pour créer une poche circulaire légèrement plus grande que la taille du SVA autour du site d’incision par dissection contondante. Utilisez les ciseaux incurvés émoussés pour creuser un tunnel crânien, sur l’épaule droite, vers l’incision ventrale au niveau du cou, en ouvrant légèrement les ciseaux, puis en tirant les ciseaux ouverts et en répétant l’action au fur et à mesure qu’elle est enfoncée.REMARQUE: La souris peut être tournée sur son côté gauche pour cette étape. Une fois que le tunnel a atteint l’incision ventrale, passez à travers des pinces chirurgicales de l’incision ventrale à l’incision dorsale. Fixez l’extrémité 3Fr du cathéter à la pince et tirez le cathéter à travers le tunnel afin qu’il soit hors de l’incision du col ventral et que le SVA soit en place à l’incision dorsale. Insérez le disque de feutre chirurgical du VA par voie sous-cutanée à l’incision à l’arrière. Détachez le cathéter et rincez avec une solution saline ou une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (PBS-/-), vérifiez la perméabilité en utilisant l’extrémité de la fourche de l’outil de manipulation pour retirer le capuchon protecteur en aluminium, puis utilisez l’extrémité magnétique pour maintenir le bouton et injecter avec une seringue de 1 mL fixée à l’injecteur correspondant jusqu’à ce que le liquide fuie de l’extrémité 1Fr.NOTE: Le rinçage du cathéter peut également être effectué à l’étape 2.1. Appuyez sur le bouton caudale dans la poche et fermez la peau sur le disque feutre du SAV, sous la bride du SAV, avec au moins deux sutures interrompues 4-0 crâniennement.REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de tension sur la peau autour du bouton. Cathétérisme veineux (7-10 min, réalisé au microscope)Retournez la souris en décubitus dorsal, vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement d’orteil et ajoutez une goutte de solution saline au site de coupe. Attachez la première ligature autour du cathéter et de la veine jugulaire avec 2-3 nœuds aussi loin que possible crânienne pour ligaturer la veine et ancrer le cathéter à l’extérieur. Déplacez la deuxième ligature aussi près que possible des muscles pectoraux. Raccourcissez le cathéter à la longueur requise de sorte que ~3-5 mm du cathéter soit dans la veine en coupant avec des micro-ciseaux à un angle diagonal pour créer une extrémité tranchante. Percez un trou dans la veine à l’aide d’une aiguille de 27 G fixée à une seringue de 1 ml remplie de solution saline en tirant sur la ligature crânienne sécurisée et en poussant l’aiguille parallèlement à la veine.REMARQUE: Si le sang de refoulement fuit de la veine, utilisez un coton-tige pour appliquer une pression jusqu’à ce que le saignement cesse. Insérez le cathéter dans la veine de la même manière en tirant sur la ligature crânienne sécurisée et en glissant le cathéter dans la veine à l’aide de la pince à épiler pliée. Poussez le cathéter jusqu’à ce qu’il soit aligné avec la veine. Attachez la deuxième ligature sur la région où le cathéter est inséré dans la veine avec 2-3 nœuds et vérifiez qu’il n’y a pas de fuite de sang. Une troisième ligature et une partie du tissu adipeux local peuvent être utilisées pour sécuriser le cathéter. Coupez l’extrémité excédentaire des deux ligatures avec des micro-ciseaux et ajoutez une goutte de solution saline. Fermez la peau avec des sutures interrompues résorbables 4-0. Injectez à la souris 10% de glucose dans une solution saline à 10 μL / g de souris par voie sous-cutanée. Injectez à la souris le volume désiré d’inhibiteur ou de PBS/solution saline en utilisant l’extrémité de la fourche de l’outil de manipulation pour retirer le capuchon protecteur en aluminium, puis l’extrémité magnétique pour maintenir le bouton et injecter avec une seringue de 1 mL fixée à l’injecteur.REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas d’air ou de bulles d’air dans la seringue d’injection en appuyant sur le piston jusqu’à ce qu’une goutte de liquide sorte avant l’injection. Maintenez une pression positive sur le piston tout en déconnectant la seringue avec l’injecteur du SAV pour éviter d’aspirer du sang dans l’extrémité du cathéter et de provoquer un blocage du cathéter. Appliquez un vaporisateur de povidone iodée sur la plaie fermée et laissez la souris reprendre conscience sous une lampe chauffante, puis remettez-la dans la cage avec 7,5 mg de piritramide (pour une gestion prolongée de la douleur) et 20 ml de glucose à 5% dans 200 ml d’eau potable pendant 3 jours après l’opération. Vérifiez les souris plusieurs fois par jour pour des signes de douleur ou de détresse. Injections quotidiennes (<5 min)Pour l’injection quotidienne, placer la souris dans la chambre d’anesthésie à 3%-4% d’isoflurane mélangé à 2 L/min O2 jusqu’à ce qu’elle soit inconsciente et que son rythme respiratoire soit ralenti, puis injecter comme à l’étape 2.12.10. Vérifiez le cou pour détecter tout signe d’enflure après l’injection, ce qui indiquerait que le cathéter n’est plus inséré dans la veine. Notez également que l’injection ne sera pas possible si le cathéter est obstrué.REMARQUE: Une injection de 10 μL / g de poids de souris 1x par jour est bien tolérée par les souris. 3.3D échographie Préparez le système d’imagerie par ultrasons, la table chauffante et le chauffe-gel, fixez le transducteur au système et installez-le au-dessus de la scène en position transversale (c.-à-d. perpendiculaire à la colonne vertébrale de la souris). À l’aide du logiciel d’échographie, réglez les paramètres pour un gain de 30 dB, une profondeur d’image de 9,0 mm et une largeur d’image de 8,08 mm. Placez la souris dans la chambre d’anesthésie à 3%-4% d’isoflurane mélangé avec 2 L/minO2 jusqu’à ce qu’elle perde connaissance. Déplacez la souris sur une table chauffée (37 °C) en décubitus dorsal et maintenez l’anesthésie à l’isoflurane à 1,8%-2% à travers un cône nasal. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Rasez la fourrure sur l’abdomen de la souris. Appliquez la crème dépilatoire pendant 1 min si nécessaire, puis essuyez et nettoyez avec de la gaze humide. Ajoutez une goutte de gel d’électrode à chacune des quatre électrodes d’électrocardiogramme (ECG) sur la scène et collez-y les extrémités de la souris. Étalez du gel à ultrasons chauds sur l’abdomen de la souris et abaissez l’émetteur pour le mettre en contact avec l’animal. Identifiez l’aorte comme un vaisseau circulaire à pulsations rapides.REMARQUE: La veine cave inférieure (IVC) sera située à côté de l’aorte, et si la sonde est fermement enfoncée, l’IVC sera comprimée tandis que l’aorte reste stable. La confirmation que le vaisseau analysé est l’aorte plutôt que l’IVC peut être obtenue en utilisant l’onde de pouls Doppler (mode PW), avec un angle de 65°. L’aorte aura une vitesse d’onde de pouls élevée. Localisez l’artère rénale gauche et surveillez manuellement la zone jusqu’à 12 mm crânienne pour vous assurer qu’il n’y a pas d’interférence dans la zone d’intérêt (c.-à-d. aorte suprarénale). Retournez à l’artère rénale gauche puis réglez la sonde à 6 mm crânienne de l’artère rénale gauche.REMARQUE: L’échographie 3D enregistrera la longueur spécifiée (c.-à-d. 12 mm) à partir de la moitié (6 mm) caudale du point d’origine et jusqu’à la longueur spécifiée (12 mm) crâniennement. Les étapes de dépannage pour les interférences comprennent une légère pression avec le transducteur, le soulèvement puis l’abaissement à nouveau, l’application de plus de gel à ultrasons et l’inclinaison de l’angle de la scène. Acquisition d’ultrasons 3DRéglez le déclenchement respiratoire sur un délai de 25% et une fenêtre de 50% et le déclencheur ECG (T1) sur 50 ms (pour enregistrer la dilatation systolique maximale de l’aorte).REMARQUE : Les contrôles respiratoires peuvent être optimisés pour chaque animal en fonction de la fréquence respiratoire et de l’effort nécessaire pour s’assurer que les artefacts de mouvement sont éliminés. À partir des options 3D, définissez la distance de numérisation sur 11,96 mm avec une taille de pas de 0,076 mm, ce qui donne 157 images. Le programme acquerra automatiquement les 157 images en environ 1-2 min. Faites défiler pour vérifier la qualité de l’image, répétez si la qualité de l’image est inférieure, puis enregistrez l’image. Acquisition de diamètre 2DDésactivez le déclenchement respiratoire et l’ECG, et localisez manuellement la zone ayant le plus grand diamètre dans l’étirement de 12 mm de l’aorte suprarénale. Acquérir une image en mode B16. De plus, sans déplacer le transducteur, obtenez une image de visualisation kilohertz dépendante par ECG (EKV) avec les paramètres standard du système sur le même site. Fin de l’analyseEssuyez le gel à ultrasons de l’abdomen et remettez la souris dans sa cage. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. 4. Analyse échographique Analyse des volumesDans le logiciel d’analyse, ouvrez l’image du mode 3D et, sous le menu Traitement de l’image, appuyez sur Charger en 3D, qui compilera les 157 images 2D en une image 3D (cube). Dans le menu Mesure du volume , choisissez Méthodes parallèles et rotationnelles, puis le logiciel affichera l’image 3D dans un seul volet. Sous Volume, appuyez sur Démarrer et dessinez le premier contour autour de la paroi interne de l’aorte en cliquant pour ajouter le premier point, en déplaçant le curseur autour de l’aorte, puis en cliquant avec le bouton droit pour terminer le contour. Sautez 9-10 images (0,75-1 mm), puis dessinez un autre contour de la même manière. Répétez ces étapes jusqu’à ce que la dernière image soit atteinte. Cela devrait se traduire par 16-17 contours.REMARQUE: Les première et dernière images doivent avoir des contours dessinés pour que le volume correct sur 12 mm puisse être calculé. Sélectionnez le premier contour dans le menu et choisissez Affiner. Cela lancera l’algorithme de détection des bords pour ajuster étroitement la ligne à la paroi du navire. Déplacez les points sur le contour en les faisant glisser vers une nouvelle position afin que le contour aligne avec précision le bord de la paroi interne de l’aorte.REMARQUE: Dans le modèle Ang-II, un thrombus intra-muros peut être présent. Comme il s’agit d’une caractéristique commune de ce modèle, la mesure du volume devrait inclure le thrombus. Affinez tous les contours et appuyez sur Terminer pour enregistrer l’analyse. Le volume calculé sera affiché dans le coin inférieur gauche. Analyse du diamètreREMARQUE : Les mesures de diamètre peuvent être effectuées de l’intérieur à l’intérieur, de la paroi extérieure à la paroi extérieure ou de la paroi intérieure à la paroi extérieure, mais elles doivent être cohérentes pour toutes les mesures. Cependant, dans le modèle Ang-II, un thrombus intra-muros pourrait être présent, ce qui devrait être inclus dans l’analyse.À partir de l’image en mode 3D : Évaluez les 157 images pour identifier le diamètre maximal par inspection visuelle. Ensuite, dans le menu Mesure , choisissez Linéaire et tracez plusieurs lignes sur l’aorte pour déterminer le plus grand diamètre. À partir de l’image en mode B ou EKV (visualisation kilohertz ECG-gated : Dans la boucle ciné, identifier l’expansion maximale de l’aorte (au niveau de la systole) par inspection visuelle. Ensuite, dans le menu Mesure , choisissez Linéaire et tracez plusieurs lignes sur l’aorte pour déterminer le plus grand diamètre.REMARQUE: L’ECG peut être utilisé pour déterminer le cycle cardiaque, mais l’identification visuelle donne des résultats précis.