アンジオテンシンII誘発腹部大動脈瘤のマウスモデルにおける中心静脈カテーテルによる薬物治療と3D超音波によるモニタリング

動物実験は、科学目的で使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63/EUおよびオーストリア動物実験法2012に準拠して、地元の倫理委員会とオーストリア科学省(BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016)によって承認されました。人道的なエンドポイントは、≥15%の体重減少、食物および/または水分摂取の回避、活動の低下(低運動症)またはジスキネジア、または痛み/症状管理にもかかわらず、長時間の振盪、引っ掻き傷、呼吸困難、またはむしゃがんだ姿勢で設定された。必要に応じて、動物を深い麻酔下、すなわちケタミン(約100mg / kg)およびキシラジン(約5mg / kg)の過剰摂取カクテル、または子宮頸部脱臼によって安楽死させる。外科的処置のために、無菌技術および滅菌/清潔な手袋が全体を通して使用される。 1. ポンプ注入 麻酔ApoE欠損マウス(B6.129P2-Apoetm1Unc/J)を通常の食事に保ち、好ましくは12〜14週齢の雄動物を実験に含めて、ヒト疾患における雄優勢を表す3。 手術の1日前(d-1、pre-OP)に、製造業者のプロトコールに従ってマウス体重に従って所望の濃度のアンジオテンシンIIを浸透圧ポンプに調製および充填し、ポンプを37°Cの生理食塩水中で一晩インキュベートする15。例:25 g のマウスの場合、送達速度が 1000 ng/kg/min、ポンプ速度が 0.25 μL/h の浸透圧ポンプ( 材料表を参照) を 28 日間使用し、1.8 mg の Ang-II を 300 μL の生理食塩水に溶解させます (1500 ng/h の Ang-II を送達するには 6000 ng/μL 濃度)。鈍い充填針で溶液をポンプにロードし、フローモデレータを挿入してポンプを閉じます。 無意識になるまで、 2 L / minのO2と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れます。マウスを臥位にある加熱テーブル(37°C)に移動し、鼻錐を通してイソフルラン麻酔を1.8%〜2%に維持する。 両目に目滑剤を塗布して乾燥を防ぎます。 生理食塩水中の2.5%ブプレノルフィンをマウス皮下10μL/gで注射し、つま先ピンチで麻酔の深さを確認します。 マウスの左上にある小さな領域を肩甲骨の上に剃ります。剃毛した部分の消毒のために10%(w / v)のポビドンヨード溶液を塗布する。 ポンプ挿入(5-7分、顕微鏡なしで実施)マウスがつま先のピンチで完全に麻酔をかけられていることを確認し、中脊髄線と左肩甲骨線の間にメスを入れて背中上部の皮膚に1cm横切開します。 鉗子で皮膚を持ち上げ、鈍い湾曲したはさみを使用して、左後肢に向かって押して皮下ポケットを作ります。はさみを開き、開いたはさみをカットから引き出し、繰り返してポケットを広げます。 フローモデレーターでポンプをポケットにそっと挿入し、尾部に向かって(切開部位によるAng-II放出の潜在的な干渉を最小限に抑えるため)。注:ポケットは、ポンプを挿入するのに十分な幅であるだけでなく、皮膚がポンプの周囲にきつくならないようにし、最適な創傷治癒を可能にするためにポンプと切開部位の間に少なくとも5mmある必要があります。 4-0吸収性の中断された縫合糸で創傷を閉じる。 マウスの生理食塩水中に10%グルコースをマウス皮下10μL/gで注射する。 閉じた創傷にポビドンヨード創傷スプレーを塗布し、マウスが加熱ランプの下で意識を回復できるようにしてから、手術後3日間、7.5mgのピリトラミド(拡張疼痛管理用)および20mLの飲料水中の5%グルコース20mLをケージに戻す。 痛みや苦痛の兆候がないか1日に数回マウスをチェックしてください。注:大動脈破裂は20%〜40%の割合で、主に手術後最初の3〜10日以内に起こるため、頻繁な動物モニタリングによって長期にわたる重度の痛みまたは苦痛のリスクを最小限に抑える必要があります。差し迫った破裂の主な適応症には、グループからの分離、むしゃがんだ姿勢、可動性の低下(後肢麻痺の程度まで)、および取り扱い中の応答性の低下または非応答性が含まれる。 2. 頸静脈カテーテル法 注:この外科的処置には、倍率8倍〜10倍の顕微鏡が必要です。 血管アクセスシステム(材料表を参照)を使用して、 3Fr側を所望の長さ(シリコーンアンカーの〜5〜7mm前)に切断し、血管アクセスシステム(VAS)の22G金属コネクタにカテーテルを少なくとも3mm重なり合って押して、カテーテルを準備する。アルミキャップをボタンの上に置き、ポートを保護します。 長さ1-1.5 cmの6-0シルク合字を準備します。 無意識になるまで、 2 L / minのO2と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れます。 マウスを仰臥位で加熱したテーブル(37°C)に移動し、鼻錐を通してイソフルラン麻酔を1.8%〜2%に維持する。 両目に目滑剤を塗布して乾燥を防ぎます。 マウスの生理食塩水中に2.5%のブプレノルフィンをマウス皮下10μL/gで注射する。 腹側と背中上部の右側に首の右側から毛皮を剃ります(左側には浸透圧ポンプが埋め込まれます)。 剃毛された領域の消毒のためにポビドンヨード溶液を適用する。 マウスがつま先のつまみによって完全に麻酔をかけられていることを確認します。 頸静脈調製(5-10分、顕微鏡下で実施)右鎖骨の上に首の右側に0.5cmの横方向の鎖骨上皮膚切開を行う。 鈍い顕微手術用ピンセットを使用して結合組織と脂肪を分離し、外頸静脈を露出させます。脂肪中の小さな血管を引き裂かないでください。 胸筋の近くに、少なくとも5mmの血管を隔離する。 曲がったマイクロピンセットを使用して静脈の下の組織を鈍く解剖し、6-0合字の2-3を通過する。注:関心のある領域に側枝が特定されている場合は、合字を側枝の尾側になるように挿入するか、側枝を分離して6-0の合字で結束することによって恒久的に結紮する必要があります。 合字を入れて、サイトに生理食塩水を一滴加えます。 ボタンの埋め込み(5-7分、顕微鏡なしで実施)マウスをひっくり返して、臥位に置きます。つま先のピンチで麻酔の深さを確認し、剃毛された領域を消毒するためにポビドンヨード溶液を塗布する。 中脊髄線と右肩甲骨線の間にメスを入れて、背中上部に1cmの矢状切開をします。 鈍い湾曲したはさみを使用して、鈍い解剖によって切開部位の周りのVASのサイズよりわずかに大きい円形のポケットを作ります。 鈍い湾曲したはさみを使って、はさみをわずかに開き、開いたはさみを引っ張り出し、さらに押し込むようにして、右肩の上を首の腹側切開部に向かって頭蓋にトンネルを掘ります。メモ: この手順では、マウスの左側をオンにできます。 トンネルが腹側切開部に到達したら、腹側から背側切開部までの外科用クランプを通過する。 カテーテルの3Fr端をクランプに取り付け、カテーテルをトンネルを通して引っ張って、腹側頸部切開部から出、VASが背側切開部で所定の位置に来るようにします。 VASの外科用フェルト椎間板を背中の切開部の皮下に挿入する。 カテーテルのクランプを外し、カルシウムとマグネシウムを含まない生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS-/-)で洗い流し、ハンドリングツールのフォークエンドを使用して保護アルミニウムキャップを取り外して開存性を確認し、磁気端を使用してボタンを保持し、液体が1Fr端から漏れるまで対応するインジェクタに取り付けられた1mLシリンジで注入します。注:カテーテルフラッシングは、代わりにステップ2.1で実施することができます。 ポケットの中のボタンを尾状に押し、VASのフランジの下にあるVASのフェルトディスクの上に皮膚を閉じ、少なくとも2つの4-0中断縫合糸を頭蓋内に閉じます。メモ: ボタンの周りのスキンに張力がないことを確認します。 静脈カテーテル検査(7-10分、顕微鏡下で実施)マウスを仰臥位に戻して、つま先のつまみで麻酔の深さを確認し、切断部位に生理食塩水を1滴加えます。 カテーテルと頸静脈の周りの最初の結紮をできるだけ頭蓋方向に2〜3ノットで結び、静脈を滑らかにし、カテーテルを外側に固定します。第2の結紮を胸筋にできるだけ近づける。 カテーテルを必要な長さに短くし、カテーテルの約3〜5mmが静脈内になるように、マイクロハサミで斜めの角度で切断して鋭い端を作成します。 固定された頭蓋合字を引っ張り、針を静脈に平行に押し込むことによって、生理食塩水で満たされた1mLシリンジに取り付けられた27G針を使用して静脈に穴を開ける。メモ:逆流による血液が静脈から漏れた場合は、綿棒を使用して出血が止まるまで圧力をかけます。 同様に、固定された頭蓋合字を引っ張り、曲がったピンセットを使用してカテーテルを静脈にスライドさせて、カテーテルを静脈に挿入します。カテーテルが静脈に揃うまでカテーテルを押します。 カテーテルが静脈に挿入されている領域に2〜3ノットで2番目の結紮を結び、血液漏れがないことを確認します。第3の結紮およびいくつかの局所脂肪組織は、カテーテルをさらに固定するために使用され得る。 両方の合字の余分な端をマイクロハサミで切り取り、生理食塩水を加えます。 4-0吸収性の中断された縫合糸で皮膚を閉じる。 マウスの生理食塩水中に10%グルコースをマウス皮下10μL/gで注射する。 ハンドリングツールのフォークエンドを使用して保護アルミニウムキャップを取り外し、次に磁気端を使用してボタンを押したまま、インジェクタに取り付けられた1mLシリンジで注入して、所望の量の阻害剤またはPBS /生理食塩水をマウスに注入する。メモ:注射前に液体が一滴出るまでプランジャーを押して、注射シリンジに空気や気泡がないことを確認してください。注射器付きのシリンジをVASから外しながらプランジャーに陽圧を維持し、血液をカテーテル先端に引き込み、カテーテル閉塞を引き起こすのを防ぎます。 閉じた創傷にポビドンヨード創傷スプレーを塗布し、マウスが加熱ランプの下で意識を回復できるようにしてから、手術後3日間、7.5mgのピリトラミド(拡張疼痛管理用)および20mLの飲料水中の5%グルコース20mLをケージに戻す。 痛みや苦痛の兆候がないか1日に数回マウスをチェックしてください。 毎日の注射(<5分)毎日の注射では、マウスが意識を失い、呼吸数が遅くなるまで、2L /minO2 と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れ、ステップ2.12.10のように注射する。注射後の腫れの兆候がないか首をチェックし、カテーテルが静脈に挿入されなくなったことを示します。また、カテーテルが閉塞している場合、注射は不可能であることに注意してください。注:10 μL/gのマウス体重1日あたり1倍の注射は、マウスによる忍容性が良好である。 3.3D超音波 超音波イメージングシステム、加熱テーブル、およびゲルウォーマーを準備し、トランスデューサをシステムに取り付け、横方向の位置(すなわち、マウス脊椎に垂直)でステージの上にセットアップする。 超音波ソフトウェアを使用して、ゲインが30dB、画像深度が9.0mm、画像幅が8.08mmになるように設定を調整します。 無意識になるまで、 2 L / minのO2と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れます。マウスを仰臥位で加熱したテーブル(37°C)に移動し、鼻錐を通してイソフルラン麻酔を1.8%〜2%に維持する。 両目に目滑剤を塗布して乾燥を防ぎます。 マウスの腹部の毛皮を剃る。必要に応じて脱毛クリームを1分間塗布し、湿ったガーゼで拭き取ってきれいにします。 ステージ上の4つの心電図(ECG)電極のそれぞれに電極ゲルを一滴加え、マウスの四肢をそれらにテープで留めます。 温かい超音波ゲルをマウスの腹部に広げ、送信機を下げて動物と接触させます。 大動脈を円形の高速脈動血管として識別する。注:下大静脈(IVC)は大動脈の隣にあり、プローブがしっかりと押さえられていると、大動脈が安定したままIVCが圧縮されます。分析された血管がIVCではなく大動脈であるという確認は、65°の角度を有する脈波ドップラー(PWモード)を使用して得ることができる。大動脈は高い脈波速度を有するであろう。 左腎動脈の位置を特定し、関心領域(すなわち、腎上大動脈)に干渉がないことを確認するために、頭蓋内最大12mmまで手動で領域を調査する。左腎動脈に戻り、プローブを左腎動脈から頭蓋方向に6mmにセットします。注:3D超音波は、原点から尾方向に半分(6mm)から始まり、指定された長さ(12mm)まで頭蓋方向に指定された長さ(すなわち、12mm)を記録します。干渉のトラブルシューティング手順には、探触子をわずかに押し下げる、探触子を持ち上げてから再度下げる、超音波ゲルをさらに塗布する、ステージの角度を傾けることが含まれます。 3D超音波取得呼吸ゲーティングを25%の遅延、50%のウィンドウ、ECGトリガー(T1)を50ミリ秒(大動脈のピーク収縮期拡張を記録するため)に設定します。注:呼吸ゲーティングは、呼吸数と運動アーチファクトが確実に除去されるように努力に基づいて、各動物に最適化することができます。 3D オプションから、スキャン距離を 11.96 mm に設定し、ステップサイズを 0.076 mm に設定すると、157 フレームになります。 プログラムは自動的に約1〜2分で157フレームを取得します。スクロールして画質を確認し、サブパーの場合は繰り返してから、画像を保存します。 2D直径取得呼吸ゲーティングとECGトリガーをオフにし、上腎大動脈の12mmストレッチで最大の直径を持つ領域を手動で見つけます。 Bモード画像16を取得する。 さらに、探触子を動かさずに、同じサイトでシステムの標準設定でECGゲートキロヘルツ可視化(EKV)画像を取得します。 スキャンの終了腹部から超音波ゲルを拭き取り、マウスをケージに戻します。マウスが完全に回復するまでマウスを監視します。 4. 超音波分析 ボリューム分析解析ソフトウェアで 3D モード画像を開き、[ 画像処理 ] メニューの [3D に読み込み] を押すと、157 個の 2D フレームが 3D 画像 (キューブ) にコンパイルされます。 体積測定メニューで、「平行法と回転法」を選択すると、3D イメージが 1 つのペインに表示されます。 [ ボリューム] で [ スタート] キーを押し、クリックして最初の点を追加し、カーソルを大動脈の周囲に移動して右クリックして輪郭を完成させて、大動脈の内壁の周りに最初の輪郭を描画します。 9 ~ 10 フレーム(0.75 ~ 1 mm)をスキップし、同じ方法で別の輪郭を描きます。最後のフレームに達するまで、これらの手順を繰り返します。これにより、16-17の輪郭が生まれます。メモ: 12 mm を超える正しいボリュームを計算するには、最初と最後のフレームに輪郭を描く必要があります。 メニューから最初の輪郭を選択し、「 絞り込み」を選択します。これにより、エッジ検出アルゴリズムが開始され、ラインが容器壁に密接にフィットします。輪郭上の点を新しい位置にドラッグして移動し、輪郭が大動脈の内壁の端に正確に並ぶようにします。注:Ang-IIモデルでは、壁内血栓が存在する可能性があります。これはこのモデルの一般的な特徴であるため、体積測定には血栓を含める必要があります。 すべての輪郭を微調整し、「 終了」(Finish) を押して解析を保存します。計算されたボリュームが左下隅に表示されます。 直径解析メモ: 直径の測定は、内壁から内壁、外壁、または内壁から外壁まで行うことができますが、すべての測定で一貫している必要があります。しかし、Ang-IIモデルでは、壁内血栓が存在する可能性があり、これは分析に含めるべきである。3Dモード画像から:157フレームを評価し、目視検査によって最大直径を特定します。次に、 測定 メニューから 「線形」 を選択し、大動脈に複数の線を引いて最大直径を決定します。 BモードまたはEKV(ECGゲートキロヘルツビジュアライゼーション)画像から:シネループで、目視検査によって大動脈の最大膨張(収縮期)を特定します。次に、 測定 メニューから 「線形」 を選択し、大動脈に複数の線を引いて最大直径を決定します。注:ECGは心周期を決定するために使用することができますが、視覚的な識別は正確な結果をもたらします。