Trattamento farmacologico mediante catetere venoso centrale in un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale indotto da angiotensina II e monitoraggio mediante ecografia 3D
Summary
Questo protocollo descrive l’impianto consecutivo di una pompa osmotica per indurre l’aneurisma dell’aorta addominale mediante rilascio di angiotensina II in topi carenti di apolipoproteina E (ApoE) e di una porta di accesso vascolare con catetere della vena giugulare per il trattamento farmacologico ripetuto. Il monitoraggio dello sviluppo dell’aneurisma mediante ecografia 3D viene condotto efficacemente nonostante gli impianti dorsali.
Abstract
Poiché mancano opzioni di trattamento farmaceutico nella gestione clinica dell’aneurisma dell’aorta addominale (AAA), i modelli animali, in particolare i modelli murini, vengono applicati per far progredire la comprensione della patogenesi della malattia e per identificare potenziali bersagli terapeutici. Testare nuovi farmaci candidati per bloccare la crescita di AAA in questi modelli richiede generalmente la somministrazione ripetuta di farmaci durante il corso dell’esperimento. Qui, descriviamo un protocollo compilato per l’induzione AAA, l’inserimento di un catetere endovenoso per facilitare la terapia prolungata e il monitoraggio seriale AAA mediante ultrasuoni 3D. Gli aneurismi sono indotti nei topi carenti di apolipoproteina E (ApoE) dal rilascio di angiotensina II nell’arco di 28 giorni da minipompe osmotiche impiantate per via sottocutanea nella schiena del topo. Successivamente, viene condotta la procedura chirurgica per il cateterismo venoso giugulare esterno per consentire il trattamento farmacologico endovenoso quotidiano o il prelievo di sangue ripetuto tramite un pulsante di accesso vascolare sottocutaneo. Nonostante i due impianti dorsali, il monitoraggio dello sviluppo di AAA è prontamente facilitato dall’analisi ecografica 3D semi-automatizzata sequenziale, che fornisce informazioni complete sull’espansione del diametro e del volume aortico e sulla morfologia dell’aneurisma, come illustrato da esempi sperimentali.
Introduction
Un aneurisma dell’aorta addominale (AAA) è una dilatazione patologica di un vaso a causa di processi infiammatori e distruttivi dei tessuti nella parete aortica che possono portare alla rottura e alla morte del paziente. Nonostante i notevoli risultati nella riparazione chirurgica dell’AAA, ad oggi manca un trattamento farmacologico conservativo per bloccare la progressione dell’espansione dell’aneurisma e potenzialmente ridurre il rischio di rottura. Sono stati sviluppati modelli animali per chiarire i fattori scatenanti e i mediatori della malattia e per testare nuovi approcci alla terapia. I modelli murini di AAA sono ampiamente applicati e coprono le diverse osservazioni dal tessuto umano. A causa delle loro differenze pathomemeccanicistiche, spesso viene applicato più di un modello per indagare la particolare funzione di molecole/vie o l’efficacia di potenziali farmaci terapeutici 1,2. Tra i modelli più comunemente usati di induzione AAA c’è la somministrazione di angiotensina-II (Ang-II) in topi con deficit di apolipoproteina E (ApoE KO)3, che ha più patogenesi cronica rispetto ai modelli che si basano sulla formazione di aneurisma da un insulto acuto alla parete aortica 4,5. Pertanto, il modello Ang-II sembra particolarmente adatto per monitorare la progressione della malattia e recentemente è stato dimostrato che assomiglia molto alla malattia umana AAA per quanto riguarda le risposte metaboliche e infiammatorie6. In particolare, il modello Ang-II presenta non solo lo sviluppo di AAA, ma anche la formazione di aneurisma toracico, nonché la dissezione aortica con formazione di trombo intramurale.
I trattamenti volti a mirare alla progressione dell’AAA già stabilita piuttosto che prevenire l’inizio della malattia possono avere un valore traslazionale più elevato in quanto i pazienti presentano una condizione preesistente che richiede il trattamento 7,8. Per un disegno sperimentale comparabile, la dimensione aortica deve essere monitorata prima e dopo l’induzione di AAA per definire una soglia di sviluppo della malattia e potenzialmente stratificare i topi in gruppi di trattamento.
La modalità di somministrazione del farmaco dipende dall’assorbimento e dalla stabilità della rispettiva sostanza. Le iniezioni intraperitoneali (i.p.) sono più spesso utilizzate a causa della loro facilità di applicazione, non richiede anestetico e della mancanza di vincoli di volume di iniezione9. La farmacocinetica deve essere considerata, tuttavia, quando si sceglie la via di somministrazione, poiché le sostanze somministrate per via endovenosa vengono assorbite principalmente attraverso la circolazione portale epatica e possono subire un metabolismo epatico prima di raggiungere la circolazione, il che potrebbe comportare concentrazioni plasmatiche variabili a seconda dell’effetto di primo passaggio10. L’iniezione endovenosa (e.v.) produce la massima biodisponibilità delle sostanze e la sfida dell’accesso ripetitivo per via endovenosa può essere aggirata mediante l’uso di cateteri e porte di accesso vascolare per la somministrazione quotidiana11,12,13. Per quanto riguarda l’impostazione AAA, la distribuzione del farmaco in circolazione facilita l’esposizione diretta all’aneurisma a concentrazioni definite.
Qui, descriviamo un flusso di lavoro per indurre AAA nel modello murino Ang-II tramite l’impianto sottocutaneo di una pompa osmotica, per il trattamento farmacologico quotidiano e.v. tramite una porta di accesso vascolare collegata a un catetere inserito nella vena giugulare esterna, nonché per il monitoraggio delle dimensioni dell’aneurisma tramite ecografia 3D14 nonostante la presenza di due impianti dorsali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello Ang-II è uno dei modelli murini più comunemente usati di AAA a causa delle sue basse esigenze tecniche e delle caratteristiche particolari che ricordano la malattia umana 3,6. Il tempo di intervento è di circa 10 minuti per animale e l’impianto della pompa sottocutanea è ben tollerato dai topi se la tasca sottocutanea è sufficientemente ampia e posizionata in basso sulla schiena dell’animale, lontano dal sito di incisione, in modo da non interferire con la guarigione della ferita. Quando la pelle è tesa intorno alla pompa, può verificarsi irritazione dei tessuti, che può causare infiammazione e croste e potenzialmente interrompere il meccanismo di rilascio della pompa dalla pressione osmotica. Misurare il volume di Ang-II rimasto nella pompa al momento del sacrificio animale fornisce informazioni sul fatto che l’Ang-II sia stato rilasciato con successo nei 28 giorni.
Il modello Ang-II è stato recentemente proposto per essere adatto per studiare l’aneurisma aortico e la progressione della dissezione in quanto mostra somiglianza con le caratteristiche umane di entrambi6. È importante sottolineare che testare farmaci candidati per bloccare l’espansione aortica e influenzare il rimodellamento corrisponderebbe all’attuale domanda clinica. Nel nostro contesto sperimentale, un cutoff per la formazione di aneurisma è stato definito prima dell’inizio del trattamento sulla base di una crescita del volume del 125% al giorno 8 rispetto al basale, che spiega la variazione naturale delle dimensioni assolute dell’aorta nei topi. La soglia e il punto temporale sono stati derivati da un decorso temporale iniziale che ha confermato la distruzione della parete dell’aorta in istologia (dati non mostrati) e ha provocato rotture del 35% e il 56% di AAA osservati prima dell’impianto del catetere. Mentre una soglia minima di malattia stabilita è stata applicata per l’inclusione nello studio, è stato successivamente osservato che un’elevata estensione dell’espansione iniziale dell’aorta può anche limitare l’applicabilità sperimentale. Gli aneurismi che progredivano rapidamente al >200% del volume entro il giorno 8 non crescevano ulteriormente oltre quella dimensione nel 55% dei casi (Figura 1D). Questo deve essere preso in considerazione durante la progettazione sperimentale e il calcolo delle dimensioni del campione, in quanto potrebbe mascherare il vero effetto di un trattamento. Un altro aspetto di questo modello sono le frequenti rotture aortiche (toraciche o addominali), che si verificano a tassi del 20% -40% e per lo più entro i primi 10 giorni dopo l’impianto della pompa Ang-II 3,18,19. Pertanto, scegliendo l’inizio del trattamento per il giorno 9, è stato raggiunto un alto tasso di aneurismi stabiliti, e il cateterismo della vena giugulare è stato essenzialmente eseguito su topi che avrebbero dovuto sopravvivere fino alla fine dell’esperimento (solo 3/24 topi nel nostro gruppo di controllo storico si sono rotti dopo il giorno 9), risparmiando così tempo, sforzo, e costi.
A parte le rotture dell’aorta, che costituiscono una condizione grave, l’impianto concomitante del catetere con pulsante di accesso vascolare e della pompa osmotica è stato ben tollerato dai topi, senza effetti degni di nota sulla mobilità o sul comportamento dopo il recupero dall’intervento chirurgico. La procedura di cateterismo della vena giugulare dovrebbe richiedere circa 30 minuti per i ricercatori addestrati. La durata dell’esposizione all’anestesia (isoflurano) deve essere ridotta al minimo e la frequenza respiratoria animale deve essere attentamente monitorata per prevenire la depressione respiratoria, che può portare a un esito fatale se non risolta20. La perdita di sangue dopo aver perforato la vena giugulare per l’inserimento del catetere – che porta alla morte dell’animale se grave – potrebbe potenzialmente verificarsi quando la vena giugulare non è adeguatamente legata cranicamente o un ramo laterale che alimenta l’area isolata del vaso non è chiuso. In tal caso, la pressione con un batuffolo di cotone deve essere applicata al sito di puntura fino a quando la perdita di sangue rallenta o si ferma, quindi l’inserimento del catetere e la legatura devono essere eseguiti il più rapidamente possibile; Un piccolo pezzo della medicazione della ferita di collagene può essere temporaneamente utilizzato per aiutare con l’emostasi.
La pervietà del catetere è uno dei fattori più importanti, poiché la disconnessione del catetere dalla vena o dal pulsante di accesso provoca una consegna impropria del farmaco in cui il farmaco fuoriesce nello spazio sottocutaneo. Seguendo la raccomandazione del produttore di una sovrapposizione minima di 3 mm tra il catetere e il connettore metallico, solo un caso di disconnessione del catetere sul lato del pulsante (indicato dal liquido iniettato che fuoriesce dal sito di incisione sul pulsante) è stato registrato in 3 anni in questo modello (2020-2021, n = 73), che è stato risolto aprendo la ferita e ristabilendo la connessione in chirurgia. Inoltre, è stato riscontrato un tasso di fallimento della pervietà del catetere di circa il 10% nel nostro storico gruppo di controllo PBS (2/21) a causa dell’occlusione del catetere (che rende impossibile l’iniezione), della disconnessione del catetere dalla vena (indicata da apparente gonfiore del collo durante l’iniezione) o di complicazioni di guarigione della ferita. Questi problemi possono essere collegati a lesioni autoinflitte, cioè graffi o morsi di topo. In particolare, i trattamenti farmacologici che interferiscono con la guarigione delle ferite possono aumentare i tassi di fallimento. Le procedure di risoluzione dei problemi per migliorare il tasso di pervietà includono l’aumento della lunghezza del catetere inserito nella vena, assicurando che le legature siano strettamente annodate attorno al catetere e alla vena e applicando la tecnica della pressione positiva seguendo le raccomandazioni del produttore, come descritto al punto 2.12.10., durante l’iniezione. La pervietà del catetere deve inoltre essere verificata al momento del sacrificio animale mediante dissezione e ispezione visiva al microscopio. Da notare, il volume giornaliero della soluzione di farmaco iniettato deve essere attentamente considerato. Poiché il volume plasmatico regola la pressione sanguigna, il volume di iniezione può influenzare l’espansione dell’AAA e, quindi, gli animali di controllo devono ricevere la procedura fittizia con il volume del vettore. Sulla base della nostra esperienza (e di osservazioni non pubblicate), una quantità giornaliera fino a 250 μL di PBS sembra essere ben tollerata. Infine, simile all’impianto della pompa, l’irritazione della pelle può verificarsi intorno al pulsante di accesso vascolare impiantato. Se si osserva un’infiammazione accompagnata da tessuto devitalizzato o necrotico, lo sbrigliamento della ferita deve essere effettuato rimuovendo il tessuto non vitale (il tessuto necrotico spesso si separa naturalmente dalla ferita) e la pelle deve essere suturata se necessario; Se l’infiammazione e la necrosi sono estese, il benessere dell’animale e gli endpoint umani devono essere considerati secondo le linee guida.
L’impianto dorsale singolo e doppio della pompa osmotica e/o del VAS non ha interferito con il segnale ecografico né con il fissaggio del mouse in una posizione appropriata sullo stadio ecografico. L’acquisizione automatica di 157 fotogrammi su 12 mm per rendere un’immagine 3D dell’aorta per la misurazione del volume è una procedura semplice e veloce14, che richiede solo di garantire che l’aorta sia libera da interferenze sull’area di interesse. Una trappola in questo contesto è applicare troppa pressione con il trasduttore mentre si tenta di cancellare l’immagine dall’interferenza, che può interrompere la misurazione automatica se la frequenza respiratoria è influenzata dalla compressione delle costole quando vengono registrate le immagini dell’estremità cranica dell’aorta addominale. Il diametro viene tradizionalmente misurato nelle immagini acquisite utilizzando la modalità B dall’operatore che ricerca manualmente l’area di diametro massimo durante l’esecuzione dell’analisi ecografica. Un progresso rispetto alle immagini B-mode sono le immagini EKV, che possono risolvere piccoli movimenti aortici per produrre un’immagine rallentata di alta qualità dell’aorta pulsante. Inoltre, il diametro massimo dell’aorta può essere determinato dai fotogrammi 3D acquisiti, dove le 157 immagini offrono una panoramica completa dell’aorta prelevata a sistole (a causa del trigger ECG impostato).
In conclusione, il protocollo compilato presentato fornisce un flusso di lavoro affidabile e riproducibile per la somministrazione di farmaci per via endovenosa in un modello murino di AAA indotta da Ang-II e per il monitoraggio delle dimensioni aortiche mediante ultrasuoni 3D. I punti temporali di monitoraggio e funzionamento possono essere adattati alle esigenze specifiche e il cateterismo della vena giugulare può essere eseguito separatamente per qualsiasi configurazione sperimentale che richieda la somministrazione di sostanze specifiche tramite iniezioni endovenose. Il VAS può essere utilizzato in alternativa per ripetuti prelievi di sangue se viene utilizzata una soluzione di blocco del catetere per prevenire la coagulazione. La procedura ecografica 3D descritta può essere adattata per misurare l’aorta infrarenale, dove gli aneurismi si sviluppano su insulto acuto in elastasi o modelli murini basati su CaCl2 di AAA. Mentre l’acquisizione ecografica 3D ha il vantaggio di fornire una panoramica della regione dell’aorta interessata e della morfologia dell’aneurisma, l’acquisizione delle immagini richiede più tempo e, quindi, potrebbe essere più costosa. Un’altra limitazione del protocollo che dovrebbe essere riconosciuta è la necessità che gli animali vengano anestetizzati brevemente per iniezioni endovenose, mentre la somministrazione intraperitoneale viene generalmente eseguita su topi coscienti.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i team del Prof. Podesser e del Prof. Ellmeier (Dipartimento di ricerca biomedica e Core Facility for Laboratory Animal Breeding and Husbandry, Medical University of Vienna) per l’assistenza negli esperimenti sugli animali. La colorazione tricromatica AAA è stata gentilmente eseguita da Monika Weiss e dal Prof. Peter Petzelbauer (Dipartimento di Dermatologia, Università di Medicina di Vienna). Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo austriaco per la scienza [progetto SFB F 5409-B21]. Marc Bailey è personalmente supportato dalla British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
Materials
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
References
- Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS-Vascular Science. 2, 219-234 (2021).
- Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. British Journal of Pharmacology. 179 (5), 792-810 (2022).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
- Phillips, E. H., et al. Morphological and biomechanical differences in the elastase and AngII apoE -/- rodent models of abdominal aortic aneurysms. BioMed Research International. 2015, 413189 (2015).
- Gäbel, G., et al. Parallel murine and human aortic wall genomics reveals metabolic reprogramming as key driver of abdominal aortic aneurysm progression. Journal of the American Heart Association. 10 (17), 20231 (2021).
- Phie, J., Thanigaimani, S., Golledge, J. Systematic review and meta-analysis of interventions to slow progression of abdominal aortic aneurysm in mouse models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1504-1517 (2021).
- Lu, H. S., Owens, A. P., Liu, B., Daugherty, A. Illuminating the importance of studying interventions on the propagation phase of experimental mouse abdominal aortic aneurysms. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1518-1520 (2021).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: Should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Research. 37 (1), 1-17 (2020).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Derde, S., et al. Use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness. Journal of Visualized Experiments. (123), e55553 (2017).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Waduud, M. A., et al. High-frequency three-dimensional lumen volume ultrasound is a sensitive method to detect early aneurysmal change in elastase-induced murine abdominal aortic aneurysm. Aorta. 9 (6), 215-220 (2020).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013 (2019).
- Eilenberg, W., et al. Histone citrullination as a novel biomarker and target to inhibit progression of abdominal aortic aneurysms. Translational Research. 233, 32-46 (2021).
- Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (9), 1621-1626 (2003).
- Trachet, B., Fraga-Silva, R. A., Jacquet, P. A., Stergiopulos, N., Segers, P. Incidence, severity, mortality, and confounding factors for dissecting AAA detection in angiotensin II-infused mice: A meta-analysis. Cardiovascular Research. 108 (1), 159-170 (2015).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Laboratory Animals. 44 (4), 329-336 (2010).
