ブタ脳への注入のための磁気共鳴ガイド下定位固定装置

この研究は、ヒューストンメソジスト研究所の施設動物管理および使用委員会、IACUC承認番号IS00006378によって承認されました。すべての実験方法は、関連する国内および機関のガイドラインおよび規制に従って実施されました。 1.動物のポジショニング 頭蓋骨の上部に最適にアクセスできるように被験者を配置します:MRIスキャンの準備として、被験者をMRIテーブルに置きます。注:主題情報:家畜、雌、25 kg、14週齢。ケタミン(筋肉内[IM]600 mg)とミダゾラム(5 mg IM)で被験者を鎮静させます。.鎮痛薬ヒドロモルフォン(4 mg IM)、カルプロフェン(100 mg / os)、フェンタニル(25 μg局所)、抗生物質セフトリアキソン(550 mg静脈内[IV])、およびNaCl(0.9%IV)を投与します。. 被験者に挿管します。2%〜3%のイソフルランで麻酔を維持する。 手順全体を通して被験者のバイタルサインを監視します。人工呼吸器を使用して16〜19呼吸/分で機械的に換気します。 MRIスキャンの準備として、被験者をMRIテーブルに置きます。 頭をMRIボアに向けて被験者を腹臥位に置きます。 標準のMRI4チャンネルフレックスコイルをヘッドホルダーに配置します。 ヘッドホルダーで被験者の頭を安定させます。 タオルとフォームパッドで胴体を持ち上げます。目標は、頭がわずかに下に倒れ、首が曲がり、鼻がテーブルにほぼ触れることです。これは、定位フレームと注入カニューレがMRIスキャナーのボア内に収まるようにするのに役立ちます。MRIヘッドホルダーピンを両側接合体に固定して、ヘッドをMRIテーブルに固定したままにします。 首を曲げた状態で、頭蓋骨の上部がスキャナーの背面に向かって傾斜していることを確認します。この位置により、被験者がMRIに入ったときに外科医が頭皮の上部にアクセスできるようになります。 セットされると、MRIテーブルは、被験者の頭がボアの端に達するまでスキャナーのボアに移動します。 2. MRI支援可視化ガイダンスによる外科的挿入の計画 準備した材料が被験者の目に入らないように注意しながら、無菌で領域を準備します。手術部位の周りに滅菌タオルを置きます。外科医がアクセスできる頭蓋骨の上部に向かって開口部のある滅菌ドレープを配置します。 グリッドの接着側を患者の頭の上に貼り付け、バリ穴がある場所を中心に、基準計画グリッドを被験者の頭皮に配置します。 グリッドの最上部の液体で満たされた層をはがし、下層を所定の位置にしっかりと保持します。 グリッドを設定した状態でMRIスカウトスキャンを実行します。スキャンでは、血管系を視覚化するためにMR造影剤の静脈内投与が必要になることがよくあります:2.5 mLの注入量に対して1 mmol / mL濃度の造影剤ガドリニウム造影剤を使用します。注意: スカウトスキャンは、決定的な画像検査の前に撮影された予備画像です。目的は、外科医が関心領域の近くでイメージングが行われることを確認し、イメージング境界を定義することです。造影剤の1 mmol / mL濃度での推奨用量は、動物の体重1キログラムあたり0.1 mLです。 MRガイダンスソフトウェアでカニューレ挿入の正確な脳の位置を選択します。 ソフトウェアが、選択したターゲットに基づいて、カニューレ配置のための外科医の計画軌道の視覚化を可能にすることを確認してください。ソフトウェアが軌道の視覚化と対応するエントリポイントを出力することを確認します。注:この研究では、白質を標的とする前頭皮質の部位が選択されました。これは、多くのヒト神経膠腫が発生し、成長する場所です22。また、白質路23に沿った普及のための優先的な場所でもあります。注:穿孔および溝の違反を最小限に抑え、血管を回避するために、エントリポイント、ターゲット、および望ましい軌道に関する外科医の決定を検討してください。 ソフトウェアで投影されたエントリポイントとターゲットポイントを手動でドラッグして、目的のエントリポイントとターゲットポイントを含む提案された軌道を調整し、血管を回避し、椎間板と溝の違反を最小限に抑えます。軌道は3次元で変更して表示できます。 外科医の好みに基づいて目的の軌道が特定されたら、MRガイダンスソフトウェアを実行してグリッド上のエントリポイントを見つけます。スキャンで計画された軌道をスクロールして、頭皮のエントリポイントを見つけます。ソフトウェアは、グリッド上の計画された軌道の投影に基づいてグリッド座標を指定します。 3. 定位フレームを固定し、ソフトウェア投影によりアライメントを反復的に調整 最初に6本のボーン固定ネジと4本のオフセットネジでベースを固定することにより、グリッド上の目的のエントリポイント座標の周りに定位フレームを組み立てます。 6本の骨固定ネジを頭皮を通してグリッド上の頭蓋骨に固定します。6本のアンカーネジは、定位フレームを安定させ、穴あけ中の動きを避けるために使用されます。 タワーの基部にある4本のオフセットネジを、頭蓋骨に固定されているスキンを通して固定します。それらは、フレームベースをセンターネジに持ち上げることによってセンターボーンネジを締め、ベースを安定させるためのカウンターフォースとして機能します。 定位フレームベースが固定されたら、フレームの組み立てを続行します。 MRIソフトウェアのオプションである高解像度T1強調MPRAGE MRIスキャンを、フレームを所定の位置に設定してフレーム基準をキャプチャし、軌道を確認します。 ソフトウェアで目的のカニューレ挿入軌道を確認し、MRIスキャンと計画軌道を視覚化します。その後の2DターボスピンエコーMRIスキャンが行われ、フレームが所定の位置に配置されたら、フレームと被写体の位置合わせが確認されます。現在のフレーム位置と目的の軌道の間にずれがある場合、ソフトウェアは調整パラメータを出力します。注: ソフトウェアは、定位フレームの現在位置と定義されたターゲット ポイントの投影の半径方向の差を計算します。このエラーは、予測誤差を計算するために使用され、フレームを最小化するために必要な調整を計算するために使用されます。 ソフトウェアの出力調整パラメータで示されているように、サムホイールを回してピッチロールとXY調整を実行します。 ソフトウェア対応のMRIによる軌跡の視覚化を繰り返し、必要に応じてターゲットカニューレの回転および並進調整(サムホイールを使用)を実行します。 MRガイダンスソフトウェアを使用して、目的の軌道での頭蓋骨の厚さと脳までの総距離を測定します。注意: ソフトウェアは、フレームの上部(頭蓋骨にねじ込まれている)からターゲットポイントまでの距離を計算して、全長を推定します。 4.注入用のカニューレの穴あけと挿入 感染を防ぐために切開を行う前にヨウ素スクラブを使用してください。 定位フレームの下のメスを使用して、頭皮を3 cm切開します。 アクセス穴を作成する前に調整を実行して、ドリル挿入用のフレームを設定します。センターガイドチューブを取り外し、穴あけ用の3.4mmドリルビットに適合するチューブと交換します。 外科医が手動ドリルでドリルしている間、フレームを所定の位置に保持するためのアシスタントがいることを確認して、フレームの安定性を高めます。 外科医に手動ツイストドリルでドリルして、直径3.4mmのバリ穴を作成します。 2番目のドリル挿入用にフレームを設定して、バリ穴を広げ、軌道を変える可能性のある骨の衝突を回避します。4.5mmのドリルビットでドリルをセットアップします。センターガイドチューブを、この大きなドリルビットに適合するチューブと交換します。 4.5mmのバリ穴を作成します。 MRIスキャンを実行して、フレームにドリルで穴を開けるとカニューレがずれることがあるため、ターゲットカニューレが計画された軌道に戻ったことを確認します。 鋭いスタイレットで硬膜を突き刺します。 事前にプライミングされたフレーム互換の輸液カニューレを挿入します。気泡の導入を制限するために、カニューレの背圧が一定であることを確認してください。注: ソフトウェアは、計画されたターゲットに指定された深さを提供します。 定位フレーム対応注入カニューレの深さを測定し、カニューレ関連デプスストップを使用します。この深さの停止は、カニューレが所望の位置に到達し、それを超えないことを保証する。カニューレが希望の深さにとどまるようにするための追加のネジを備えたロックとドックアセンブリもあります。 5.繰り返しMRIスキャンで注入を監視する MRIスキャンを実行して、脳内の正しいターゲット位置へのカニューレの挿入を評価します。 ガドリニウムベースの造影剤との共注入として所望の薬剤の注入を開始する。注:この実験では、1 mM濃度のガドリニウムベースの造影剤を使用しましたが、これは用途に応じて調整する必要がある場合があります。合計300μLの注入量を10μL / minの速度で投与したが、これも変化してもよい。 定期的にMRIスキャンを実行して、ガドリニウムの同時注入により推測できる脳内のカニューレ挿入剤の注入と分布量を監視します。注:カニューレ先端の周りの過信号領域は、ガドリニウムベースの造影剤の存在を示しています。 注入が終了したら、ポンプを停止します。注:この研究で使用された注入速度は、300μLの容量の細胞懸濁液が完全に注入されるまで、30μL / minでした。 カニューレを取り外す前に、注入の終了後5分間カニューレを脳内にとどまらせます。注:注入カニューレは通常、逆流を減らすために注入の終了後5分間そのままにしておきます21,24。 フレームを通してカニューレを手動で取り外します。 フレームを組み立て方法と逆の順序で分解して、ヘッドからフレームを取り外します。 実行中の3-0または4-0モノクリル縫合糸で切開を閉じます。 回復の準備をするためにイソフルランをオフにします。 被験者を抜管し、獣医チームによる観察下で被験者が回復できるようにします。