Микрофлюидный подход к изучению кристаллизации льда и клатратов

1. Изготовление микрофлюидных устройств Накройте внутреннюю поверхность чашки Петри алюминиевой фольгой и поместите предварительно подготовленную форму в чашку Петри.Изготовьте формы, используя методы литографии, описанные в ссылках. Две конструкции устройств, используемые в настоящей работе, изображены на рисунке 1. Приготовьте 30-40 мл смеси PDMS, взвесив 1:10 (по весу) смесь отверждающего агента и эластомера (см. Таблицу материалов) и перемешивая непрерывно в течение приблизительно 5 минут, пока смесь не станет белой и почти непрозрачной.ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите пластиковый стаканчик на весы, налейте эластомер в чашку, а затем добавьте отверждающий агент для достижения весового соотношения 1:10. Вылейте смесь PDMS в чашку Петри с формой и дегазируйте в осушителе до тех пор, пока не останутся пузырьки (примерно 30 мин). Выпекайте форму с жидкой PDMS в духовке или на конфорке при 70 °C до получения резиноподобной консистенции. Этот процесс занимает около часа. Вырежьте устройство, проследив вокруг объектов скальпелем, позаботившись о том, чтобы продвинуться вперед скальпелем, а не вниз, так как плесень хрупкая. Снимите вырезанное устройство PDMS, поместив его вверх ногами в новую чашку Петри. Удалите пыль и частицы грязи с нижней поверхности, прикрепив и удалив кусок клейкой ленты (см. Таблицу материалов). Используйте тупую шприцевую иглу (20 Г) для пробивания отверстий в устройстве на основе отпечатанного рисунка, используя при необходимости микроскоп. Убедитесь, что отверстие проникает через другую сторону устройства, и используйте пинцет для удаления выбитых частей. Тщательно вымойте крышку (18 х 18 мм, толщиной 0,14 мм) водой с мылом, а затем изопропанолом. Используйте давление воздуха для сушки очищенного чехла. Вставьте очищенную PDMS и крышку в плазмоочиститель, закройте клапаны и включите питание, пылесос и насос. Дайте плазмоочистителю работать около минуты, установите RF в HI и позвольте некоторому количеству воздуха войти в плазмоочиститель с помощью тонкого клапана.Когда цвет окна просмотра изменится с фиолетового на розовый, дайте плазмоочистителю работать в течение 50 с и выключите радиочастоту. Держите насос включенным в течение минуты, а после его выключения постепенно открывайте главный клапан, чтобы воздух поступал в плазмоочиститель.ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным методом достижения сопоставимых результатов является теплосклеивание. Для этого метода укладывают форму на крышку и помещают ее на конфорку, установленную на 70-80 °C в течение примерно 60 минут. Прижмите поверхность PDMS к очищенному крышке и убедитесь, что они связаны, не наблюдая отслоения при небольшом подтягивании на крышке. Закрепите иглу тупой иглы на 90° (18 G) плоскогубцами и снимите пластиковый разъем шприца, чтобы удалить ее. Вставьте один конец иглы в трубку Tygon (0,020″ ID, 0,060″ OD, см. Таблицу материалов), а другой конец в одно из выбитых отверстий устройства. Повторите процесс для других отверстий. Для удаления пузырьков воздуха впрыскивайте воду/буфер в каналы стеклянным шприцем (насос необязателен, но насос здесь не использовался). Фильтруйте все жидкости фильтром 0,22 мкм перед впрыском их в устройство. Используйте блокирующий агент, такой как 1% раствор BSA, чтобы предотвратить связывание флуоресцентных AFP на стенках PDMS. Введите блокирующий агент во входной канал и дайте ему оставаться в микроканалах в течение 20 мин. Затем вводят буферный раствор во входной канал, чтобы промыть раствор BSA.ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное устройство PDMS прикрепляется к крышке вдоль его нижней поверхности, соединяется с трубкой во входных и выходных отверстиях и покрывается блокирующим агентом в его каналах. 2. Настройка микрофлюидного устройства Нанесите небольшое количество погружного масла на поверхность медной холодной ступени (см. Таблицу материалов) и нанесите его с помощью безворсовой салфетки, чтобы создать тонкий слой масла. Далее поместите чистый сапфировый диск (см. Таблицу материалов) на созданный слой масла. Нанесите каплю погружного масла на центр сапфирового диска и поместите устройство PDMS на каплю таким образом, чтобы характеристики устройства были выровнены по смотровому отверстию холодной ступени. Удерживайте устройство на месте и закрепите трубку на внешних стенках алюминиевой коробки, в которой находится холодная ступень, с помощью клейкой ленты. Запишите расположение каждой конкретной трубки. Используйте стеклянный шприц для введения 4-5 мкл раствора AF(G)P (см. Таблицу материалов) во входной канал. Закройте крышку холодной стадии.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация растворов АФП может варьироваться и определяться на основе их интенсивности флуоресценции. В настоящем протоколе диапазон концентраций составлял 5-40 мкл. 3. Образование монокристаллов в микрофлюидных каналах Продувите холодную ступень сухим воздухом/азотом, чтобы предотвратить образование конденсата внутри нее. Активируйте циркуляционную охлаждающую ванну, чтобы циркулировать воду через холодную стадию и служить в качестве теплоотвода. Запустите программу контроля температуры и установите температуру на -25 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание будет происходить, когда образец достигает температуры ~-20 °C, что можно наблюдать как внезапное затемнение и шероховатость образца. В этой точке может быть использована любая цель, предпочтительно цель 4x, которая позволяет пользователю наблюдать все микрофлюидные каналы. Медленно, повышая температуру примерно на 1 °C/5 с, приближайтесь к температуре плавления образца, которая может варьироваться от -1 до -0,2 °C в зависимости от буфера, используемого в растворе AF(G)P. Когда температура приблизится к температуре плавления, подождите, пока не будет выделено несколько монокристаллов.ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости нежелательный лед может быть локально расплавлен с помощью ИК-лазера (980 нм) (см. Таблицу материалов), который фиксируется на микроскопе. Лазер плавит близлежащие кристаллы льда до тех пор, пока он включен. В этот момент рекомендуется переключиться на 10x или 20x объективы, чтобы лучше наблюдать монокристаллы. После получения монокристалла в нужном месте вырастите кристалл путем незначительного снижения температуры (на ~0,01 °C) до тех пор, пока края кристалла не встретятся со стенками канала. Переключитесь на объектив 50x, введите раствор AF(G)P в каналы и наблюдайте за увеличением интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что белковый раствор был успешно введен в каналы. Выполняйте этот этап осторожно, чтобы избежать таяния кристалла льда во время обмена растворами. Тщательно контролируйте и регулируйте как скорость потока (применяя большее/меньшее давление на стеклянный шприц), так и температуру в процессе обмена раствором. Дайте белкам достаточно времени для накопления и связывания на поверхности кристалла.ПРИМЕЧАНИЕ: Это варьируется в зависимости от скорости накопления и адсорбции AF(G)P 5,25. В типичном эксперименте для накопления АФП допускается 5-10 мин. 4. Измерение активности термического гистерезиса (TH) ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Определите температуру плавления кристалла, регулируя температуру с небольшими шагами 0,002 °C и наблюдая самую высокую температуру, которой может подвергаться маленький кристалл без его плавления. На функции RAMP регулятора температуры установите скорость охлаждения от -0,05 до -0,01 °C/4 с и активируйте RAMP. Обратите внимание на точную температуру, при которой происходит внезапный рост кристаллов.ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение называется температурой разрыва и соответствует температуре замерзания. Разница между температурами плавления и замерзания составляет активность TH25. 5. Обмен растворами вокруг монокристаллов Убедитесь, что температура образца находится в зазоре TH, чтобы предотвратить плавление или рост кристалла во время эксперимента. Запишите процесс обмена решениями с помощью программы визуализации NIS Elements (см. Таблицу материалов) для последующего анализа данных флуоресценции. Медленно вводят буферный раствор во второе входное отверстие микрофлюидного устройства и наблюдают снижение флуоресцентного сигнала со скоростью, которая зависит от давления, приложенного к шприцу.Используйте это визуальное представление, чтобы убедиться, что приложенное давление не слишком велико, чтобы не вызвать расплавление кристалла. Последовательность изображений, демонстрирующих процесс обмена решениями, приведена на рисунке 2 . Измерьте интенсивность флуоресценции в микрофлюидном канале с помощью программы визуализации.ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал должен достигать пика в области вблизи поверхности кристалла, что указывает на связывание АФП, и должен быть относительно низким в окружающем растворе, который был промыт буфером. Измерьте активность TH после обмена раствором после шага 4. Повторите эксперимент, изолировав новый кристалл (шаги 3.3-3.5). Вводят раствор АФП стеклянным шприцем и повторяют обмен раствора (этапы 5.1-5.3). Получают новый монокристалл (этапы 3.3-3.5) и пропускают раствор АФП в каналы с помощью стеклянного шприца. 6. Эксперименты с клатратными гидратами Для получения гидратов ТГФ готовят раствор ТГФ/вода с молярным соотношением 1:15, что является объемным соотношением 1:3,326. Поддерживать это соотношение во всех растворах, используемых в следующих экспериментах, включая те, которые содержат AF(G)Ps или другие ингибиторы. Выполните шаги 1 и 2, чтобы подготовить микрофлюидное устройство и поместить его в холодную стадию. Установить температуру на -25 °C; образец замерзает при ~-20°С, как описано на этапе 3.2. После того, как раствор ТГФ заморожен, медленно увеличивайте температуру, пока весь лед не растает.ПРИМЕЧАНИЕ: Температура таяния льда немного снижена ТГФ. Чтобы убедиться, что все кристаллы льда растаяли при исключении гидратов, удерживайте температуру при 1 °C в течение 3 мин. Установите температуру на -2 °C и наблюдайте за обилием гидратов, которые появляются в микрофлюидных каналах при отсутствии ингибиторов.ПРИМЕЧАНИЕ: Гидраты ТГФ имеют форму октаэдров (рисунок 2), а в некоторых случаях кристаллы очень тонкие; таким образом, четкое наблюдение может быть сложной задачей. В этих случаях рекомендуется повторить шаги 6.4-6.5 для получения новых кристаллов. Вводят AF(G)P/ингибитор в микрофлюидный канал с помощью стеклянного шприца, регулируя температуру, чтобы убедиться, что полученные кристаллы не плавятся/не растут. Дайте молекулам ингибитора несколько минут адсорбироваться на поверхность кристалла. При необходимости измерьте активность TH после шага 4. Обменивайте раствор вокруг кристаллов, как описано в шагах 5.2-5.3.