氷およびクラスレート水和物結晶化の研究のためのマイクロ流体アプローチ

1. マイクロ流体デバイスの作製 ペトリ皿の内面をアルミホイルで覆い、あらかじめ用意した型をペトリ皿に入れます。参考文献に記載されているリソグラフィ技術を使用して金型を作製します。本研究で使用した2つのデバイス設計を 図1に示します。 硬化剤とエラストマーの1:10(重量)混合物を秤量し( 材料の表を参照)、混合物が白くほぼ不透明になるまで約5分間連続的に混合することにより、30〜40mLのPDMS混合物を調製します。注意: プラスチックカップを計量スケールに置き、エラストマーをカップに注ぎ、硬化剤を加えて1:10の重量比を実現します。 PDMS混合物を型と一緒にペトリ皿に注ぎ、気泡がなくなるまで(約30分)デシケーターで脱気します。 液体PDMSを使用して、ゴムのような粘稠度が得られるまで、70°Cのオーブンまたはホットプレートで金型を焼きます。このプロセスには約 1 時間かかります。 カビは壊れやすいので、メスではなくメスで前方に押すように注意しながら、メスで特徴の周りをなぞってデバイスを切り取ります。切り取ったPDMSデバイスを取り外し、逆さまにして新しいペトリ皿に入れます。粘着テープを貼ったり取り外したりして、底面からほこりや汚れの粒子を取り除きます(材料の表を参照)。 鈍い注射針(20 G)を使用して、必要に応じて顕微鏡を使用して、刻印パターンに基づいてデバイスに穴を開けます。穴がデバイスの反対側を貫通していることを確認し、ピンセットを使用して打ち抜かれた部分を取り除きます。 カバーガラス(18 x 18 mm、厚さ0.14 mm)を水と石鹸で徹底的に洗い、次にイソプロパノールで洗います。空気圧を使用して、クリーニングしたカバーガラスを乾燥させます。 洗浄したPDMSとカバーガラスをプラズマクリーナーに挿入し、バルブを閉じて、電源、真空、ポンプをオンにします。プラズマクリーナーを約1分間稼働させ、RFをHIに設定し、細かいバルブを使用してプラズマクリーナーに空気が入るようにします。表示ウィンドウの色が紫からピンクに変わったら、プラズマクリーナーを50秒間動作させ、RFをオフにします。ポンプを1分間オンのままにし、オフにした後、メインバルブを徐々に開いて、プラズマクリーナーに空気を入れます。注意: 同等の結果を得るための別の方法は、熱接着です。この方法では、金型をカバーガラスの上に置き、70〜80°Cに設定されたホットプレートに約60分間置きます。 PDMSの表面をクリーニングしたカバーガラスに押し付け、カバーガラスを少し引き上げたときに剥離がないことを確認して、カバーガラスが接着されていることを確認します。 90°鈍い針(18 G)の針をペンチで固定し、プラスチック製のシリンジコネクタを引き抜いて取り外します。針の一方の端をタイゴンチューブ(0.020インチID、0.060インチOD、 材料表を参照)に挿入し、もう一方の端をデバイスのパンチアウト穴の1つに挿入します。他の穴についてもこのプロセスを繰り返します。 気泡を除去するには、ガラスシリンジを使用してチャネルに水/バッファーを注入します(ポンプはオプションですが、ここではポンプを使用しませんでした)。デバイスに注入する前に、0.22μmフィルターですべての液体をろ過します。 1%BSA溶液などのブロッキング剤を使用して、蛍光標識されたAFPがPDMS壁に結合するのを防ぎます。ブロッキング剤を入口チャネルに注入し、マイクロチャネルに20分間留まらせます。次に、緩衝液を入口チャネルに注入してBSA溶液を洗い流します。注意: 得られたPDMSデバイスは、底面に沿ってカバーガラスに取り付けられ、入口と出口の穴でチューブに接続され、チャネルでブロッキング剤でコーティングされます。 2. マイクロ流体デバイスのセットアップ 銅のコールドステージの表面に少量の浸漬オイルを塗布し( 材料の表を参照)、糸くずの出ないワイプを使用して広げて、オイルの薄い層を作成します。次に、作成した油層の上にきれいなサファイアディスク( 材料表を参照)を置きます。液浸オイルの液滴をサファイアディスクの中央に塗布し、デバイスの機能がコールドステージの表示穴に揃うようにPDMSデバイスを液滴に配置します。 デバイスを所定の位置に保持し、粘着テープを使用してコールドステージを収容するアルミニウムボックスの外壁にチューブを固定します。特定の各チューブの配置をメモします。 ガラスシリンジを使用して、4〜5 μLのAF(G)P溶液( 材料の表を参照)を入口チャネルに注入します。コールドステージの蓋を閉めます。注:AFP溶液の濃度は、蛍光強度に基づいて変化させ、決定することができます。本プロトコールでは、濃度の範囲は5〜40μLであった。 3. マイクロ流体チャネルにおける単結晶の形成 コールドステージを乾燥した空気/窒素でパージして、内部に結露が発生しないようにします。循環冷却槽をアクティブにして、コールドステージに水を循環させ、ヒートシンクとして機能します。 温度制御プログラムを開始し、温度を-25°Cに設定します。注:サンプルが~-20°Cの温度に達すると凍結が発生し、サンプルの突然の暗色化と粗面化として観察できます。この時点で任意の対物レンズ、好ましくは4倍対物レンズを使用することができ、これにより、ユーザーはマイクロ流体チャネル全体を観察できます。 ゆっくりと温度を約1°C / 5秒上昇させ、AF(G)P溶液に使用されるバッファーに応じて-1〜-0.2°Cの範囲でサンプルの融点に近づきます。温度が融点に近づいたら、いくつかの単結晶が分離されるまで待ちます。注:必要に応じて、顕微鏡に固定されているIRレーザー(980 nm)を使用して不要な氷を局所的に溶かすことができます( 材料の表を参照)。レーザーは、オンになっている限り、近くの氷の結晶を溶かします。 この時点で、単結晶をよりよく観察するために、10倍または20倍の対物レンズに切り替えることをお勧めします。目的の位置に単結晶を得た後、結晶の端がチャネル壁に合うまで温度をわずかに下げて(~0.01°C)、結晶を成長させます。 50倍対物レンズに切り替え、AF(G)P溶液をチャンネルに注入し、蛍光強度の増加を観察して、タンパク質溶液がチャンネルに正常に注入されたことを示します。溶液の交換中に氷結晶が溶けないように、この手順を慎重に実行してください。溶液交換プロセス中の流量(ガラスシリンジに増減する圧力を加えることにより)と温度の両方を注意深く監視および調整します。 タンパク質が蓄積して結晶表面に結合するのに十分な時間を与えます。注意: これは、AF(G)P 5,25の蓄積率と吸着率によって異なります。典型的な実験では、AFPの蓄積に5〜10分かかります 4. 熱ヒステリシス(TH)活性測定 注: この手順はオプションです。 0.002°Cの小さなステップで温度を調整し、小さな結晶が溶けることなくさらすことができる最高温度を観察することにより、結晶の融点を決定します。 温度コントローラーの ランプ 機能で、冷却速度を-0.05〜-0.01°C / 4秒に設定し、ランプをアクティブにします。突然の結晶成長が起こる正確な温度に注意してください。注:この値はバースト温度と呼ばれ、凍結温度に対応します。融解温度と凍結温度の差はTH活性25である。 5. 単結晶周りの溶液交換 実験中の結晶の融解や成長を防ぐために、サンプル温度がTHギャップ内にあることを確認してください。 後で蛍光データ解析を行うために、NIS Elementsイメージングプログラム( 材料表を参照)を使用して溶液交換プロセスを記録します。マイクロ流体デバイスの第2の入口に緩衝溶液をゆっくりと注入し、シリンジに加えられる圧力に依存する速度で蛍光シグナルの減少を観察します。この視覚的表現を使用して、結晶が溶けないように、加えられた圧力が高すぎないようにしてください。ソリューション交換プロセスを示す一連の画像については、 図2 を参照してください。 イメージングプログラムを使用してマイクロ流体チャネル内の蛍光強度を測定します。注:シグナルは、AFP結合を示す結晶の表面近くの領域でピークに達し、バッファーでフラッシュされた周囲の溶液では比較的低いはずです。 ステップ4に続いて溶液交換後のTH活性を測定します。 新しい結晶を分離して実験を繰り返します(ステップ3.3〜3.5)。ガラスシリンジでAFP溶液を注入し、溶液交換を繰り返します(手順5.1〜5.3)。新しい単結晶を入手し(ステップ3.3〜3.5)、ガラスシリンジを使用してAFP溶液をチャネルに流します。 6. 包接水和物を用いた実験 THF水和物を得るには、モル比1:15、つまり体積比1:3.326のTHF /水溶液を準備します。AF(G)Psまたは他の阻害剤を含むものを含む、以下の実験で使用されるすべての溶液でこの比率を維持します。. 手順1と2に従ってマイクロ流体デバイスを準備し、コールドステージに配置します。温度を-25°Cに設定します。サンプルは、ステップ3.2で説明されているように、~-20°Cで凍結します。 THF溶液が凍結した後、すべての氷が溶けるまでゆっくりと温度を上げます。注:氷の融点はTHFによってわずかに低下します。 水和物を除いてすべての氷の結晶が確実に溶けるように、温度を1°Cで3分間保持します。 温度を-2°Cに設定し、阻害剤の非存在下でマイクロ流体チャネルに現れる水和物の存在量を観察します。注:THFハイドレートは八面体の形をしており(図2)、場合によっては結晶が非常に薄いことがあります。したがって、明確な観察は難しいかもしれません。このような場合は、手順6.4〜6.5を繰り返して新しい結晶を取得することをお勧めします。 得られた結晶が溶融/成長しないように温度を調整しながら、ガラスシリンジを使用してAF(G)P/阻害剤をマイクロ流体チャネルに注入します。阻害剤分子が結晶表面に吸着するまで数分待ちます。 必要に応じて、ステップ4に従ってTH活性を測定します。 手順5.2〜5.3で説明されているように、結晶の周りの溶液を交換します。