Mevcut protokol, mikroakışkan cihazlarda mikroskobik buz kristallerinin ve klatrat hidratların kristalleşmesini tanımlamakta ve oluşan kristallerin etrafında sıvı değişimini sağlamaktadır. Bu, inhibitörlerin kristalleşme sürecini ve bağlanma mekanizmalarını incelemek için eşsiz olanaklar sağlar.
Su kristalizasyonunun doğru bir mekanik tanımı zordur ve birkaç temel unsur gerektirir: tek mikroskobik kristallerin oluşumuna izin vermek için mükemmel sıcaklık kontrolü ve soğuk aşamaya bağlı uygun bir mikroskopi sistemi. Burada açıklanan yöntem, buz ve klatrat hidrat kristalleri etrafında çözelti alışverişini içeren bir başka önemli özellik daha ekler. Tanımlanan sistem, mikroakışkanlar, yüksek çözünürlüklü soğuk aşamalar ve floresan mikroskobu dahil olmak üzere benzersiz ve ev yapımı aletlerin bir kombinasyonunu içerir. Soğuk aşama mikroakışkan cihazlar için tasarlanmıştır ve mikroakışkan kanallar içinde mikron boyutunda buz/hidrat kristallerinin oluşumuna ve bunların etrafındaki çözeltilerin değişimine izin verir. Soğuk aşamanın sıcaklık çözünürlüğü ve stabilitesi, bu küçük kristallerin büyümesini kontrol etmek için çok önemli olan bir milikelvindir. Bu farklı sistem, buz ve hidrat kristalizasyonunun farklı süreçlerini ve bu kristallerin büyümesinin engellendiği mekanizmayı incelemek için kullanılır. Protokol, mikroakışkan cihazların nasıl hazırlanacağını, mikroakışkan kanallardaki mikroskobik kristallerin nasıl yetiştirileceğini ve kontrol edileceğini ve buz / hidrat kristallerinin etrafındaki sıvı akışının kullanılmasının suyun kristalleşmesine nasıl yeni bilgiler sağladığını açıklar.
Antifriz proteinleri (AFP’ler) ve antifriz glikoproteinleri (AFGP’ler) soğuğa adapte olmuş çeşitli organizmaları don hasarlarından korur1. AFP’ler ve AFGP’ler (AF (G) Ps olarak genelleştirilmiştir), yüzeylerine geri dönüşümsüz olarak bağlanarak ve Gibbs-Thomson etkisi 2,3,4,5 nedeniyle daha fazla büyümeyi inhibe ederek buz kristallerinin büyümesini inhibe eder. Büyük ölçüde değişmemiş olan erime sıcaklığı ile yeni depresif donma sıcaklığı arasında oluşan boşluğa termal histerezis (TH) denir ve AFP aktivitesine karşılık gelen ölçülebilir bir parametreyi temsil eder6. Buz büyümesini engellemek için AFP’lerin kullanılması, kriyoprezervasyon, dondurulmuş gıda kalitesi ve soğuğa maruz kalan mahsullerin korunması dahil olmak üzere çeşitli alanlarda potansiyel iyileştirme sunan geniş kapsamlı ve çeşitli uygulamalara sahiptir.
Küçük organik moleküllerin varlığında suyun düşük sıcaklıklarda ve yüksek basınçlarda kristalleşmesi, en bol hidratın metan hidrat7 olduğu klatrat hidratların (veya gaz hidratlarının) oluşumuna neden olur. Metan hidratların gaz/yağ akış hatlarında kristalleşmesi, gaz ateşlemesi nedeniyle patlamalara neden olabilecek tıkaçlara neden olabilir 8,9,10. Akış hatlarında hidrat kristalleşmesini önlemeye yönelik mevcut çabalar, termodinamik (alkoller ve glikoller) ve kinetik (esas olarak polimerler) inhibitörlerinkullanılmasını içerir 11,12,13,14. AFP’lerin ayrıca hidrat kristallerini klatratmak ve büyümelerini engellemek için bağlandığı bulunmuştur, bu da AFP’lerin tıkaç oluşumunu engellemek için potansiyel kullanımına işaret eder ve böylece daha yeşil bir çözüm sağlar15.
Mikroakışkanlar, bir mikrokanal ağı üzerinden akan küçük numune hacimlerinde (fL’ye kadar) sıvıların özelliklerini incelemek için kullanılan yaygın bir yöntemdir16. Mikrokanallar, litografi17 kullanılarak bir silikon gofret (kalıp) üzerinde oluşturulan bir deseni takip eder. Mikroakışkan cihazları üretmek için yaygın olarak kullanılan bir malzeme, araştırma laboratuvarlarında çalışmak için ucuz ve nispeten basit olan polidimetilsiloksan (PDMS) ‘dir. Özelliklerin (kanalların) tasarımı, cihazın özel amacına göre oluşturulur; Böylece, DNA algılama18, tıbbi tanı19 ve kristalleşme süreçleri 3,20,21 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
Mevcut protokol, AFP’ler ve AFGP’ler de dahil olmak üzere çeşitli inhibitörlerle mikron boyutunda buz ve hidrat kristalleri yetiştirmek için benzersiz bir mikroakışkan yöntemi tanımlamaktadır. Bu deneyler için, basınç ve sıcaklık kontrolü için özel ekipman gerektiren metan gazı hidratları22’nin özelliklerini taklit etmek için Tetrahidrofuran (THF) hidratları kullanılmıştır23. Floresan etiketli AF (G) P’ler, proteinlerin kristal yüzeye adsorpsiyonunu görselleştirmek ve analiz etmek için kullanıldı ve floresan görüntüleme ile birleştiğinde, mikroakışkan yaklaşım, bu moleküllerin kristal yüzeylere bağlanma sürecinin temel özelliklerinin elde edilmesine izin verdi.
Mevcut protokol, kristal büyümesi ve inhibisyonu hakkında yeni anlayışlar ortaya çıkarmak için mikroakışkan akışın mikroskobik kristallerle kombinasyonunu kullanmak üzere tasarlanmıştır. Milikelvin çözünürlüklü sıcaklık kontrollü soğuk aşama27, mikroakışkan kanalların içinde bulunan tek mikroskobik kristallerin kontrolünü sağlar, böylece etraflarındaki çözeltilerin değişimine izin verir. Mikroakışkan cihazların imalatı standart ve yaygın uygulamalara benzer olsa da17,18, cihazın içindeki kristallerin büyümesi ve erimesi üzerindeki kontrol benzersiz ve yenidir. Bu sistemdeki en kritik bileşen, Peltier termoelektrik soğutucular, numuneye yakın bir yerde bulunan bir termistörden gelen geri bildirim ve geri besleme döngüsünü yöneten yüksek çözünürlüklü bir sıcaklık kontrolörü kullanılarak elde edilen üstün sıcaklık kontrolüdür.
Bir diğer kritik adım, bu işlem sırasında kristaller eriyebileceği veya büyüyebileceği için çözelti değişiminin kendisidir; Bu nedenle, büyümeyi/erimeyi önlemek için çözelti değişimi sırasında sıcaklık ayarlanmalıdır. Mikroakışkan kanallarda kristallerin oluşumu sıvı akışına müdahale eder ve bu sistemin ana zorluğunu oluşturur; Bu nedenle, bu kristallerin büyümesi kontrol edilmelidir. Burada, ters çevrilmiş mikroskop üzerine bir IR lazer (980 nm) monte edildi ve istenmeyen buz / hidrat kristallerini yerel olarak eritmek için kullanıldı28. Böyle bir lazer kullanılamıyorsa, mikroakışkan cihazın metalik konektörleri, cihazın girişindeki / çıkışındaki buzu eritecek ek bir Peltier termoelektrik soğutucu ile ısıtılabilir.
Burada açıklanan yöntem, evde geliştirilen aletleri (soğuk aşama) içerir ve yukarıda belirtilen adımların bazıları zorlu olduğu için eğitim gerektirir. Kristalleri çevreleyen çözeltinin konsantrasyonu, akış amaçlanmadığında bile değişebileceğinden, basit bir kalibrasyon adımı5 , floresan sinyaline dayanarak konsantrasyonun güvenilir bir tahminini sağlayabilir. İstenmeyen akışa (örneğin TH ölçümleri sırasında) bir başka olası çözüm, referans4’te açıklanan mikroakışkan valflerdir.
Bu sistem aynızamanda D2O buzunH2O sıvısındaki büyüme davranışını araştırmak için de kullanıldı, bu da mikroskobik, taraklı buz yüzeylerinin yeni bir fenomenini ortaya çıkardı27. Böylece, mikroakışkanlar, sıcaklık değişimlerine iyi yanıt veren çeşitli kristalin sistemlerin incelenmesinde kullanılabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırmanın desteklenmesi için Amerikan Kimya Derneği Petrol Araştırma Fonu Bağışçılarına teşekkür edilir (Hibe numarası 60191-UNI5). Yazarlar, antifriz proteinlerini ve buzu incelemek için mikroakışkan cihazların kullanımına öncülük ettiği için Prof. Ido Braslavsky’ye teşekkür eder. Yazarlar, antifriz protein örnekleri sağladıkları için Prof. Arthur DeVries, Prof. Konrad Meister ve Prof. Peter Davies’e teşekkür etmektedir.
0.22-micron filters | Fisher Scientific | ||
90-degree bent blunt needles | 18 Gauge | ||
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins | A gift | See references 5 and 28 | |
Blunt needles | 18 Gauge and 20 Gauge | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | ||
Cold stage | Home made | ||
Cover slips | Globe Scientific | 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness | |
Glass syringe | |||
Infrared laser 980 nm | Opto Engine LLC | ||
Inverted microscope, Eclipse Ti – S | Nikon | ||
Invisible tape | Staples | ||
lint-free wipe | Kimwipes | ||
Newport 3040 temperature controller | Newport 3040 | ||
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Oil vacuum pump | Harrick Plasma | ||
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) | Dow Corning Syglard | ||
Safranine O | Sigma-Aldrich | S2255-25G | |
Sapphire disc | Ted Pella Inc | 16005-1010 | 25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness |
sCMOS Camera, Neo 5.5 | Andor | ||
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-100ML | |
Tygon Microbore tubing for microfluidic device | Cole-Parmer | 0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll. | |
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas | Cole-Parmer | 1/8” ID, 3/16” OD |