Een microfluïdische benadering voor de studie van ijs- en clathraathydraatkristallisatie

1. Fabricage van microfluïdische apparaten Bedek het binnenoppervlak van een petrischaal met aluminiumfolie en plaats de vooraf bereide vorm in de petrischaal.Fabriceer de mallen met behulp van de lithografietechnieken die in referenties worden beschreven. De twee apparaatontwerpen die in het huidige werk worden gebruikt, zijn afgebeeld in figuur 1. Bereid 30-40 ml van het PDMS-mengsel door een mengsel van 1:10 (in gewicht) van het uithardingsmiddel en het elastomeer te wegen (zie materiaaltabel) en gedurende ongeveer 5 minuten continu te mengen totdat het mengsel wit en bijna ondoorzichtig lijkt.OPMERKING: Plaats een plastic beker op de weegschaal, giet het elastomeer in de beker en voeg vervolgens het uithardingsmiddel toe om een gewichtsverhouding van 1:10 te bereiken. Giet het PDMS-mengsel met de vorm in de petrischaal en ontgas in een exsiccator totdat er geen bubbels achterblijven (ongeveer 30 min). Bak de mal met de vloeibare PDMS in een oven of op een hete plaat op 70 °C tot een rubberachtige consistentie is verkregen. Dit proces duurt ongeveer een uur. Knip het apparaat uit door de kenmerken met een scalpel te traceren en zorg ervoor dat je met het scalpel naar voren duwt in plaats van naar beneden, omdat de mal kwetsbaar is. Verwijder het uitgesneden PDMS-apparaat en plaats het ondersteboven in een nieuwe petrischaal. Verwijder stof- en vuildeeltjes van het bodemoppervlak door een stuk plakband te bevestigen en te verwijderen (zie Materiaaltabel). Gebruik een stompe spuitnaald (20 G) om gaten in het apparaat te ponsen op basis van het bedrukte patroon, indien nodig met behulp van een microscoop. Zorg ervoor dat het gat door de andere kant van het apparaat dringt en gebruik een pincet om de uitgestanste stukken te verwijderen. Was een deklip (18 x 18 mm, 0,14 mm dik) grondig met water en zeep en vervolgens met isopropanol. Gebruik luchtdruk om de gereinigde coverslip te drogen. Plaats de gereinigde PDMS en coverslip in de plasmareiniger, sluit de kleppen en schakel de stroom, stofzuiger en pomp in. Laat de plasmareiniger ongeveer een minuut draaien, stel de RF in op HI en laat wat lucht in de plasmareiniger komen met behulp van de fijne klep.Wanneer de kleur van het kijkvenster verandert van paars naar roze, laat u de plasmareiniger 50 s werken en schakelt u de RF uit. Houd de pomp een minuut aan en open na het uitschakelen geleidelijk de hoofdklep om lucht in de plasmareiniger toe te laten.OPMERKING: Een alternatieve methode om vergelijkbare resultaten te bereiken is warmtebinding. Leg voor deze methode de mal op de afdekplaat en plaats deze op een kookplaat op 70-80 °C gedurende ongeveer 60 minuten. Druk het PDMS-oppervlak op de gereinigde coverslip en bevestig dat ze zijn gehecht door geen loslating te observeren wanneer u iets op de coverslip optrekt. Bevestig de naald van een 90° stompe naald (18 G) met een tang en trek de plastic spuitconnector eraf om deze te verwijderen. Steek het ene uiteinde van de naald in een Tygon-buis (0,020″ ID, 0,060″ OD, zie Materiaaltabel) en het andere uiteinde in een van de uitgestanste gaten van het apparaat. Herhaal het proces voor de andere gaten. Om luchtbellen te verwijderen, injecteert u water/buffer in de kanalen met een glazen spuit (een pomp is optioneel, maar hier is geen pomp gebruikt). Filter alle vloeistoffen met een filter van 0,22 μm voordat u ze in het apparaat injecteert. Gebruik een blokkerende agent zoals een 1% BSA-oplossing om de binding van fluorescentie-gelabelde AFP’s op de PDMS-wanden te voorkomen. Injecteer het blokkerende middel in het inlaatkanaal en laat het gedurende 20 minuten in de microkanalen blijven. Injecteer vervolgens de bufferoplossing in het inlaatkanaal om de BSA-oplossing weg te spoelen.OPMERKING: Het resulterende PDMS-apparaat is bevestigd aan een afdeksel langs het bodemoppervlak, verbonden met buizen in de inlaat- en uitlaatgaten en bedekt met een blokkerend middel in de kanalen. 2. Het microfluïdische apparaat instellen Breng een kleine hoeveelheid dompelolie aan op het oppervlak van de koperen koude fase (zie Materiaaltabel) en verdeel deze met een pluisvrij doekje om een dunne laag olie te maken. Plaats vervolgens een schone saffierschijf (zie Materiaaltabel) op de gecreëerde olielaag. Breng een druppel dompelolie aan op het midden van de saffierschijf en plaats het PDMS-apparaat op de druppel zodat de functies van het apparaat worden uitgelijnd over het kijkgat van de koude fase. Houd het apparaat op zijn plaats en bevestig de slang met plakband aan de buitenwanden van de aluminium doos waarin het koude podium is ondergebracht. Noteer de plaatsing van elke specifieke buis. Gebruik een glazen spuit om 4-5 μL AF(G)P-oplossing (zie materiaaltabel) in het inlaatkanaal te injecteren. Sluit het deksel van de koude fase.OPMERKING: De concentratie van de AFP-oplossingen kan worden gevarieerd en bepaald op basis van hun fluorescentie-intensiteit. In het huidige protocol was het bereik van concentraties 5-40 μL. 3. Vorming van enkelvoudige kristallen in de microfluïdische kanalen Reinig de koude fase met droge lucht / stikstof om te voorkomen dat er condensatie in ontstaat. Activeer een circulerend koelbad om water door de koude fase te laten circuleren en dien als koellichaam. Start het temperatuurregelingsprogramma en stel de temperatuur in op -25 °C.OPMERKING: Bevriezing vindt plaats wanneer het monster een temperatuur van ~ -20 ° C bereikt, wat kan worden waargenomen als een plotselinge verduistering en opruwing van het monster. Elk doel kan op dit punt worden gebruikt, bij voorkeur het 4x-objectief, waarmee de gebruiker het geheel van de microfluïdische kanalen kan observeren. Langzaam, waarbij de temperatuur met ongeveer 1 °C/5 s wordt verhoogd, nadert u het smeltpunt van het monster, dat kan variëren van -1 tot -0,2 °C, afhankelijk van de buffer die in de AF(G)P-oplossing wordt gebruikt. Als de temperatuur het smeltpunt nadert, wacht je tot een paar enkele kristallen zijn geïsoleerd.OPMERKING: Indien nodig kan ongewenst ijs lokaal worden gesmolten met behulp van een IR-laser (980 nm) (zie Tabel van materialen), die op de microscoop wordt bevestigd. De laser smelt nabijgelegen ijskristallen zolang deze aan staat. Op dit punt wordt aanbevolen om over te schakelen naar 10x of 20x objectieven om enkele kristallen beter te observeren. Na het verkrijgen van een enkel kristal op de gewenste locatie, laat het kristal groeien door de temperatuur enigszins te verlagen (met ~ 0,01 ° C) totdat de randen van het kristal de kanaalwanden ontmoeten. Schakel over naar het 50x-objectief, injecteer de AF(G)P-oplossing in de kanalen en observeer de toename van de fluorescentie-intensiteit, wat aangeeft dat de eiwitoplossing met succes in de kanalen is geïnjecteerd. Voer deze stap zorgvuldig uit om smelten van het ijskristal tijdens de uitwisseling van oplossingen te voorkomen. Controleer en pas zowel het debiet (door meer/minder druk uit te oefenen op de glazen spuit) als de temperatuur tijdens het oplossingsuitwisselingsproces nauwlettend aan. Geef de eiwitten voldoende tijd om zich op te hopen en te binden aan het kristaloppervlak.OPMERKING: Dit varieert op basis van de accumulatie- en adsorptiesnelheden van de AF(G)P 5,25. In een typisch experiment is 5-10 minuten toegestaan voor AFP-accumulatie 4. Thermische hysterese (TH) activiteitsmeting OPMERKING: Deze stap is optioneel. Bepaal het smeltpunt van het kristal door de temperatuur aan te passen met kleine stappen van 0,002 °C en de hoogste temperatuur in acht te nemen waaraan een klein kristal kan worden blootgesteld zonder dat het smelt. Stel op de RAMP-functie van de temperatuurregelaar de koelsnelheid in op -0,05 tot -0,01 °C/4 s en activeer de RAMP. Noteer de exacte temperatuur waarbij plotselinge kristalgroei optreedt.OPMERKING: Deze waarde wordt de burst-temperatuur genoemd en komt overeen met de temperatuur van het vriespunt. Het verschil tussen de smelt- en vriestemperaturen is de TH-activiteit25. 5. Oplossingsuitwisseling rond enkelvoudige kristallen Zorg ervoor dat de monstertemperatuur zich in de TH-opening bevindt om het smelten of groeien van het kristal tijdens het experiment te voorkomen. Leg het oplossingsuitwisselingsproces vast met behulp van het NIS Elements-beeldvormingsprogramma (zie Materiaaltabel) voor latere fluorescentiegegevensanalyse. Injecteer de bufferoplossing langzaam in de tweede inlaat van het microfluïdische apparaat en observeer een afname van het fluorescerende signaal met een snelheid die afhankelijk is van de druk die op de spuit wordt uitgeoefend.Gebruik deze visuele weergave om ervoor te zorgen dat de uitgeoefende druk niet te hoog is om het kristal niet te laten smelten. Zie figuur 2 voor een reeks afbeeldingen die het oplossingsuitwisselingsproces demonstreren. Meet de fluorescentie-intensiteit in het microfluïdische kanaal met behulp van het beeldvormingsprogramma.OPMERKING: Het signaal moet pieken in het gebied nabij het oppervlak van het kristal, wat wijst op AFP-binding, en moet relatief laag zijn in de omringende oplossing, die met buffer is gespoeld. Meet de TH-activiteit na de oplossingsuitwisseling volgens stap 4. Herhaal het experiment door een nieuw kristal te isoleren (stappen 3.3-3.5). Injecteer de AFP-oplossing met een glazen spuit en herhaal de oplossingsuitwisseling (stappen 5.1-5.3). Verkrijg een nieuw enkel kristal (stappen 3.3-3.5) en laat de AFP-oplossing met behulp van de glazen spuit in de kanalen stromen. 6. Experimenten met clathraathydraten Om THF-hydraten te verkrijgen, bereidt u een THF/water-oplossing met een molaire verhouding van 1:15, wat een volumeverhouding is van 1:3,326. Handhaaf deze verhouding in alle oplossingen die in de volgende experimenten worden gebruikt, inclusief oplossingen die AF(G)Ps of andere remmers bevatten. Volg stap 1 en 2 om het microfluïdische apparaat voor te bereiden en in de koude fase te plaatsen. Stel de temperatuur in op -25 °C; het monster bevriest bij ~-20 °C zoals beschreven in stap 3.2. Nadat de THF-oplossing is bevroren, verhoogt u langzaam de temperatuur totdat al het ijs is gesmolten.OPMERKING: Het smeltpunt van ijs wordt enigszins verlaagd door de THF. Om ervoor te zorgen dat alle ijskristallen smolten met uitsluiting van de hydraten, houdt u de temperatuur gedurende 3 minuten op 1 °C. Stel de temperatuur in op -2 °C en observeer de overvloed aan hydraten die in de microfluïdische kanalen verschijnen in afwezigheid van remmers.OPMERKING: THF-hydraten hebben de vorm van octaëders (figuur 2) en in sommige gevallen zijn de kristallen erg dun; duidelijke observatie kan dus een uitdaging zijn. In deze gevallen wordt aanbevolen om stap 6.4-6.5 te herhalen om nieuwe kristallen te verkrijgen. Injecteer de AF(G)P/inhibitor in het microfluïdische kanaal met behulp van de glazen spuit terwijl u de temperatuur aanpast om ervoor te zorgen dat de verkregen kristallen niet smelten/groeien. Wacht een paar minuten voordat de remmende moleculen aan het kristaloppervlak adsorberen. Meet indien nodig de TH-activiteit volgens stap 4. Wissel de oplossing rond de kristallen zoals beschreven in stap 5.2-5.3.