Ein mikrofluidischer Ansatz zur Untersuchung der Eis- und Clathrathydratkristallisation

1. Herstellung mikrofluidischer Bauelemente Bedecken Sie die Innenfläche einer Petrischale mit Aluminiumfolie und legen Sie die vorbereitete Form in die Petrischale.Stellen Sie die Formen mit den in Referenzen beschriebenen Lithographietechniken her. Die beiden in der vorliegenden Arbeit verwendeten Gerätedesigns sind in Abbildung 1 dargestellt. Bereiten Sie 30-40 ml der PDMS-Mischung vor, indem Sie eine Mischung aus Härter und Elastomer im Verhältnis 1:10 (nach Gewicht) wiegen (siehe Materialtabelle) und etwa 5 Minuten lang kontinuierlich mischen, bis die Mischung weiß und nahezu undurchsichtig erscheint.HINWEIS: Stellen Sie einen Plastikbecher auf die Waage, gießen Sie das Elastomer in den Becher und fügen Sie dann das Härter hinzu, um ein Gewichtsverhältnis von 1:10 zu erreichen. Gießen Sie die PDMS-Mischung mit der Form in die Petrischale und entgasen Sie in einem Exsikkator, bis keine Blasen mehr übrig sind (ca. 30 min). Die Form mit dem flüssigen PDMS im Ofen oder auf einer heißen Platte bei 70 °C backen, bis eine gummiartige Konsistenz entsteht. Dieser Vorgang dauert etwa eine Stunde. Schneiden Sie das Gerät aus, indem Sie die Merkmale mit einem Skalpell nachzeichnen, und achten Sie darauf, mit dem Skalpell nach vorne zu drücken, anstatt nach unten, da die Form zerbrechlich ist. Entfernen Sie das ausgeschnittene PDMS-Gerät, und legen Sie es kopfüber in eine neue Petrischale. Entfernen Sie Staub- und Schmutzpartikel von der Unterseite, indem Sie ein Stück Klebeband anbringen und entfernen (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine stumpfe Spritzennadel (20 G), um Löcher in das Gerät basierend auf dem aufgedruckten Muster zu stanzen, gegebenenfalls mit einem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass das Loch durch die andere Seite des Geräts dringt, und verwenden Sie eine Pinzette, um die ausgestanzten Teile zu entfernen. Waschen Sie ein Deckglas (18 x 18 mm, 0,14 mm dick) gründlich mit Wasser und Seife und dann mit Isopropanol. Verwenden Sie Luftdruck, um das gereinigte Deckglas zu trocknen. Legen Sie das gereinigte PDMS und das Deckglas in den Plasmareiniger ein, schließen Sie die Ventile und schalten Sie den Strom, das Vakuum und die Pumpe ein. Lassen Sie den Plasmareiniger etwa eine Minute laufen, stellen Sie den RF auf HI ein und lassen Sie etwas Luft mit dem Feinventil in den Plasmareiniger eindringen.Wenn sich die Farbe des Sichtfensters von lila zu rosa ändert, lassen Sie den Plasmareiniger 50 s lang arbeiten und schalten Sie den RF aus. Lassen Sie die Pumpe eine Minute lang eingeschaltet und öffnen Sie nach dem Ausschalten allmählich das Hauptventil, um Luft in den Plasmareiniger zu lassen.HINWEIS: Eine alternative Methode, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, ist die Wärmeverklebung. Für diese Methode legen Sie die Form auf das Deckglas und legen Sie es für ca. 60 min auf eine auf 70-80 °C eingestellte Heizplatte. Drücken Sie die PDMS-Oberfläche auf das gereinigte Deckglas und bestätigen Sie, dass sie verbunden sind, indem Sie beim leichten Hochziehen auf dem Deckglas keine Ablösung beachten. Befestigen Sie die Nadel einer 90° stumpfen Nadel (18 G) mit einer Zange und ziehen Sie den Kunststoffspritzenstecker ab, um sie zu entfernen. Führen Sie ein Ende der Nadel in ein Tygon-Rohr (0,020″ ID, 0,060″ OD, siehe Materialtabelle) und das andere Ende in eines der ausgestanzten Löcher des Geräts ein. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Bohrungen. Um Luftblasen zu entfernen, injizieren Sie Wasser/Puffer mit einer Glasspritze in die Kanäle (eine Pumpe ist optional, aber hier wurde keine Pumpe verwendet). Filtern Sie alle Flüssigkeiten mit einem 0,22-μm-Filter, bevor Sie sie in das Gerät injizieren. Verwenden Sie ein Blockmittel wie eine 1% ige BSA-Lösung, um die Bindung von fluoreszenzmarkierten AFPs an die PDMS-Wände zu verhindern. Injizieren Sie das Blockmittel in den Einlasskanal und lassen Sie es 20 min in den Mikrokanälen verbleiben. Injizieren Sie dann die Pufferlösung in den Einlasskanal, um die BSA-Lösung auszuspülen.HINWEIS: Das resultierende PDMS-Gerät wird an einem Deckglas entlang seiner Unterseite befestigt, mit Schläuchen in seinen Einlass- und Auslasslöchern verbunden und in seinen Kanälen mit einem Blockiermittel beschichtet. 2. Einrichtung des mikrofluidischen Geräts Tragen Sie eine kleine Menge Tauchöl auf die Oberfläche der Kupferkaltstufe auf (siehe Materialtabelle) und verteilen Sie es mit einem fusselfreien Tuch, um eine dünne Ölschicht zu erzeugen. Als nächstes legen Sie eine saubere Saphirscheibe (siehe Materialtabelle) auf die erzeugte Ölschicht. Tragen Sie einen Tropfen Tauchöl auf die Mitte der Saphirscheibe auf und positionieren Sie das PDMS-Gerät so auf dem Tropfen, dass die Merkmale des Geräts über dem Sichtloch der kalten Bühne ausgerichtet sind. Halten Sie das Gerät fest und befestigen Sie den Schlauch mit Klebeband an den Außenwänden des Aluminiumkastens, in dem sich die kalte Bühne befindet. Notieren Sie sich die Platzierung jedes spezifischen Röhrchens. Injizieren Sie mit einer Glasspritze 4-5 μL AF(G)P-Lösung (siehe Materialtabelle) in den Einlasskanal. Schließen Sie den Deckel der kalten Bühne.HINWEIS: Die Konzentration der AFP-Lösungen kann anhand ihrer Fluoreszenzintensität variiert und entschieden werden. Im vorliegenden Protokoll betrug der Konzentrationsbereich 5-40 μL. 3. Bildung von Einkristallen in den mikrofluidischen Kanälen Reinigen Sie die kalte Stufe mit trockener Luft / Stickstoff, um die Bildung von Kondenswasser im Inneren zu verhindern. Aktivieren Sie ein zirkulierendes Kühlbad, um Wasser durch die kalte Stufe zu zirkulieren und als Kühlkörper zu dienen. Starten Sie das Temperaturregelprogramm und stellen Sie die Temperatur auf -25 °C ein.HINWEIS: Das Einfrieren tritt auf, wenn die Probe eine Temperatur von ~-20 °C erreicht, was als plötzliches Verdunkeln und Aufrauen der Probe beobachtet werden kann. An dieser Stelle kann jedes Objektiv verwendet werden, vorzugsweise das 4x-Objektiv, das es dem Benutzer ermöglicht, die Gesamtheit der mikrofluidischen Kanäle zu beobachten. Langsam nähert man sich durch Erhöhung der Temperatur um ca. 1 °C/5 s dem Schmelzpunkt der Probe, der je nach verwendetem Puffer in der AF(G)P-Lösung zwischen -1 und -0,2 °C liegen kann. Wenn sich die Temperatur dem Schmelzpunkt nähert, warten Sie, bis einige Einkristalle isoliert sind.HINWEIS: Bei Bedarf kann unerwünschtes Eis lokal mit einem IR-Laser (980 nm) geschmolzen werden (siehe Materialtabelle), der am Mikroskop befestigt ist. Der Laser schmilzt in der Nähe von Eiskristallen, solange er eingeschaltet ist. An dieser Stelle wird empfohlen, auf 10x- oder 20x-Objektive umzuschalten, um Einkristalle besser beobachten zu können. Nachdem Sie einen Einkristall an der gewünschten Stelle erhalten haben, züchten Sie den Kristall, indem Sie die Temperatur leicht verringern (um ~ 0,01 ° C), bis die Ränder des Kristalls auf die Kanalwände treffen. Wechseln Sie zum 50x-Objektiv, injizieren Sie die AF(G)P-Lösung in die Kanäle und beobachten Sie die Zunahme der Fluoreszenzintensität, was darauf hinweist, dass die Proteinlösung erfolgreich in die Kanäle injiziert wurde. Führen Sie diesen Schritt sorgfältig durch, um ein Schmelzen des Eiskristalls während des Lösungsaustauschs zu vermeiden. Überwachen und passen Sie sowohl die Durchflussrate (durch Anlegen von mehr/weniger Druck auf die Glasspritze) als auch die Temperatur während des Lösungsaustauschprozesses genau an. Lassen Sie den Proteinen genügend Zeit, sich anzusammeln und an die Kristalloberfläche zu binden.ANMERKUNG: Dies variiert je nach Akkumulations- und Adsorptionsraten des AF(G)P 5,25. In einem typischen Experiment sind 5-10 min für die AFP-Akkumulation erlaubt 4. Messung der Aktivität der thermischen Hysterese (TH) HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Bestimmen Sie den Schmelzpunkt des Kristalls, indem Sie die Temperatur mit kleinen Schritten von 0,002 °C einstellen und die höchste Temperatur beobachten, der ein kleiner Kristall ausgesetzt werden kann, ohne dass er schmilzt. Stellen Sie in der RAMP-Funktion des Temperaturreglers die Kühlrate auf -0,05 bis -0,01 °C/4 s ein und aktivieren Sie den RAMP. Beachten Sie die genaue Temperatur, bei der plötzliches Kristallwachstum auftritt.HINWEIS: Dieser Wert wird als Bersttemperatur bezeichnet und entspricht der Temperatur des Einfrierens. Die Differenz zwischen Schmelz- und Gefriertemperatur beträgt die TH-Aktivität25. 5. Lösungsaustausch um Einkristalle Stellen Sie sicher, dass die Probentemperatur im TH-Spalt liegt, um das Schmelzen oder Wachstum des Kristalls während des Experiments zu verhindern. Zeichnen Sie den Lösungsaustauschprozess mit dem Bildgebungsprogramm NIS Elements (siehe Materialtabelle) für die spätere Fluoreszenzdatenanalyse auf. Injizieren Sie die Pufferlösung langsam in den zweiten Einlass des mikrofluidischen Geräts und beobachten Sie eine Abnahme des Fluoreszenzsignals mit einer Geschwindigkeit, die vom Druck abhängt, der auf die Spritze ausgeübt wird.Verwenden Sie diese visuelle Darstellung, um sicherzustellen, dass der ausgeübte Druck nicht zu hoch ist, um den Kristall nicht schmelzen zu lassen. Abbildung 2 zeigt eine Reihe von Bildern, die den Lösungsaustauschprozess veranschaulichen. Messen Sie die Fluoreszenzintensität im mikrofluidischen Kanal mit dem bildgebenden Programm.HINWEIS: Das Signal sollte in der Nähe der Oberfläche des Kristalls seinen Höhepunkt erreichen, was auf eine AFP-Bindung hinweist, und sollte in der umgebenden Lösung, die mit Puffer gespült wurde, relativ niedrig sein. Messen Sie die TH-Aktivität nach dem Lösungsaustausch nach Schritt 4. Wiederholen Sie das Experiment, indem Sie einen neuen Kristall isolieren (Schritte 3.3-3.5). Injizieren Sie die AFP-Lösung mit einer Glasspritze und wiederholen Sie den Lösungsaustausch (Schritte 5.1-5.3). Gewinnen Sie einen neuen Einkristall (Schritte 3.3-3.5) und fließen Sie die AFP-Lösung mit der Glasspritze in die Kanäle. 6. Experimente mit Clathrathydraten Um THF-Hydrate zu erhalten, wird eine THF/Wasser-Lösung mit einem molaren Verhältnis von 1:15 hergestellt, was einem Volumenverhältnis von 1:3,326 entspricht. Dieses Verhältnis sollte in allen Lösungen beibehalten werden, die in den folgenden Experimenten verwendet werden, einschließlich solcher, die AF(G)Ps oder andere Inhibitoren enthalten. Führen Sie die Schritte 1 und 2 aus, um das mikrofluidische Gerät vorzubereiten und in die kalte Phase zu stellen. Stellen Sie die Temperatur auf -25 °C ein; Die Probe gefriert bei ~-20 °C, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Nachdem die THF-Lösung gefroren ist, erhöhen Sie langsam die Temperatur, bis das gesamte Eis geschmolzen ist.HINWEIS: Der Schmelzpunkt von Eis wird durch den THF leicht gedrückt. Um sicherzustellen, dass alle Eiskristalle unter Ausschluss der Hydrate schmelzen, halten Sie die Temperatur 3 min lang bei 1 °C. Stellen Sie die Temperatur auf -2 °C ein und beobachten Sie die Fülle von Hydraten, die in den mikrofluidischen Kanälen in Abwesenheit von Inhibitoren auftreten.HINWEIS: THF-Hydrate sind als Oktaeder geformt (Abbildung 2), und in einigen Fällen sind die Kristalle sehr dünn; Daher kann eine klare Beobachtung eine Herausforderung darstellen. In diesen Fällen wird empfohlen, die Schritte 6.4-6.5 zu wiederholen, um neue Kristalle zu erhalten. Injizieren Sie den AF(G)P/Inhibitor mit der Glasspritze in den mikrofluidischen Kanal, während Sie die Temperatur einstellen, um sicherzustellen, dass die erhaltenen Kristalle nicht schmelzen/wachsen. Warten Sie einige Minuten, bis die Inhibitormoleküle an der Kristalloberfläche adsorbiert haben. Messen Sie bei Bedarf die TH-Aktivität nach Schritt 4. Tauschen Sie die Lösung um die Kristalle aus, wie in den Schritten 5.2-5.3 beschrieben.