Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica
Summary
Este protocolo descreve em detalhes a preparação de complexos nucleossômicos usando dois métodos de preparação de amostras para congelamento de grades de TEM.
Abstract
O reparo do DNA no contexto da cromatina é pouco compreendido. Estudos bioquímicos usando partículas centrais do nucleossomo, a unidade repetitiva fundamental da cromatina, mostram que a maioria das enzimas de reparo de DNA remove danos ao DNA em taxas reduzidas em comparação com o DNA livre. Os detalhes moleculares sobre como as enzimas de reparo por excisão de base (BER) reconhecem e removem danos ao DNA em nucleossomos ainda não foram elucidados. No entanto, dados bioquímicos de BER de substratos nucleossômicos sugerem que o nucleossomo apresenta diferentes barreiras estruturais dependentes da localização da lesão de DNA e da enzima. Isso indica que os mecanismos empregados por essas enzimas para remover danos ao DNA livre no DNA livre podem ser diferentes daqueles empregados em nucleossomos. Dado que a maioria do DNA genômico é reunida em nucleossomos, informações estruturais desses complexos são necessárias. Até o momento, a comunidade científica carece de protocolos detalhados para a realização de estudos estruturais tecnicamente viáveis desses complexos. Aqui, nós fornecemos dois métodos para preparar um complexo de duas enzimas BER geneticamente fundidas (Polimerase β e AP Endonuclease1) ligadas a uma lacuna de nucleotídeo único perto da entrada-saída do nucleossomo para determinação estrutural por crio-microscopia eletrônica (crio-EM). Ambos os métodos de preparação de amostras são compatíveis para vitrificar grades de qualidade via congelamento por imersão. Este protocolo pode ser usado como ponto de partida para preparar outros complexos nucleossômicos com diferentes fatores BER, fatores de transcrição pioneiros e enzimas modificadoras da cromatina.
Introduction
O DNA eucariótico é organizado e compactado por proteínas histonas, formando a cromatina. A partícula núcleo do nucleossomo (NCP) constitui a unidade repetitiva fundamental da cromatina que regula a acessibilidade às proteínas ligadoras de DNA para reparo, transcrição e replicaçãodo DNA 1. Embora a primeira estrutura cristalina de raios X do PFN tenha sido resolvida pela primeira vez há mais de duas décadas2 e muitas outras estruturas do PFN tenham sido publicadas desde3,4,5,6, os mecanismos de reparo do DNA em substratos nucleossômicos ainda não foram delineados. Descobrir os detalhes moleculares subjacentes ao reparo do DNA na cromatina exigirá a caracterização estrutural dos componentes participantes para entender como as características estruturais locais do NCP regulam as atividades de reparo do DNA. Isso é particularmente importante no contexto do reparo por excisão de base (BER), uma vez que estudos bioquímicos com enzimas BER sugerem mecanismos únicos de reparo de DNA em nucleossomos que são dependentes dos requisitos estruturais específicos da enzima para catálise e da posição estrutural da lesão de DNA dentro do nucleossomo 7,8,9,10,11,12,13 . Dado que o BER é um processo vital de reparo do DNA, há um interesse considerável em preencher essas lacunas, ao mesmo tempo em que se estabelece um ponto de partida a partir do qual outros estudos estruturais tecnicamente viáveis envolvendo complexos nucleossômicos relevantes podem ser realizados.
Cryo-EM está rapidamente se tornando o método de escolha para resolver a estrutura tridimensional (3D) de complexos cuja preparação em larga escala de amostra homogênea é desafiadora. Embora, o projeto e a purificação de NCPs complexados com um fator de reparo de DNA (NCP-DRF) provavelmente necessitarão de otimização personalizada, o procedimento apresentado aqui para gerar e congelar um complexo NCP-DRF estável fornece detalhes sobre como otimizar a preparação da amostra e da grade crio-EM. Dois fluxos de trabalho (não mutuamente exclusivos) mostrados na Figura 1 e os detalhes específicos no protocolo identificam etapas críticas e fornecem estratégias para otimizar essas etapas. Este trabalho impulsionará o campo de reparo de cromatina e DNA em uma direção onde a complementação de estudos bioquímicos com estudos estruturais se torne tecnicamente viável para melhor compreender os mecanismos moleculares do reparo de DNA nucleossomal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo específico para purificação do fator de reparo do DNA será dependente da enzima de interesse. Entretanto, existem algumas recomendações gerais, incluindo o uso de métodos recombinantes para expressão e purificação de proteínas18; se a proteína de interesse for muito pequena (<50 kDa), a determinação da estrutura por crio-EM era quase impossível até mais recentemente através do uso de sistemas de fusão19, scaffolds de ligação de nanocorpos<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Mario Borgnia do núcleo de crio-EM do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental e ao Dr. Joshua Strauss da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill por sua orientação e treinamento na preparação da grade crio-EM. Agradecemos também à Dra. Juliana Mello Da Fonseca Rezende pela assistência técnica nas etapas iniciais deste projeto. Agradecemos a contribuição e o apoio fundamentais do falecido Dr. Samuel H. Wilson e seus membros do laboratório, especialmente o Dr. Rajendra Prasad e o Dr. Joonas Jamsen para a purificação do complexo APE1-Polβ geneticamente fundido. A pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [números de bolsa Z01ES050158, Z01ES050159 e K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
