הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים
Summary
פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הכנת קומפלקסים נוקלאוזומליים באמצעות שתי שיטות להכנת דגימה להקפאת רשתות TEM.
Abstract
תיקון DNA בהקשר של כרומטין אינו מובן היטב. מחקרים ביוכימיים המשתמשים בחלקיקי ליבה נוקלאוזומים, היחידה החוזרת הבסיסית של כרומטין, מראים שרוב אנזימי תיקון הדנ”א מסירים נזק לדנ”א בקצב מופחת בהשוואה לדנ”א חופשי. הפרטים המולקולריים על האופן שבו אנזימים לתיקון כריתת בסיס (BER) מזהים ומסירים נזק לדנ”א בנוקלאוזומים לא הובהרו. עם זאת, נתוני BER ביוכימיים של סובסטרטים נוקלאוזומליים מצביעים על כך שהנוקלאוזומים מציגים מחסומים מבניים שונים התלויים במיקום נגע הדנ”א והאנזים. הדבר מצביע על כך שהמנגנונים שבהם משתמשים אנזימים אלה כדי להסיר נזק לדנ”א בדנ”א חופשי עשויים להיות שונים מאלה המופעלים בנוקלאוזומים. בהתחשב בכך שרוב הדנ”א הגנומי מורכב לנוקלאוזומים, יש צורך במידע מבני של קומפלקסים אלה. נכון להיום, הקהילה המדעית חסרה פרוטוקולים מפורטים לביצוע מחקרים מבניים אפשריים מבחינה טכנית של קומפלקסים אלה. כאן, אנו מספקים שתי שיטות להכנת קומפלקס של שני אנזימי BER מאוחים גנטית (פולימראז β ואנדונוקלאז AP1) הקשורים לפער נוקלאוטיד יחיד ליד הכניסה והיציאה של הנוקלאוזום, לצורך קביעה מבנית של מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryo-EM). שתי שיטות הכנת הדגימה תואמות לזיגוג רשתות איכותיות באמצעות הקפאת צלילה. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת מוצא להכנת קומפלקסים נוקלאוזומליים אחרים עם גורמי BER שונים, גורמי שעתוק חלוציים ואנזימים משנים כרומטין.
Introduction
דנ”א אאוקריוטי מאורגן ודחוס על ידי חלבוני היסטון, היוצרים כרומטין. חלקיק הליבה הנוקלאוזומי (NCP) מהווה את היחידה החוזרת הבסיסית של הכרומטין המווסתת את הנגישות לחלבונים קושרי DNA לצורך תיקון, שעתוק ושכפול DNA1. למרות שהמבנה הגבישי הראשון של קרני רנטגן של NCP נפתר לראשונה לפני יותר משני עשורים2 ומבנים רבים נוספים של NCP פורסמו מאז 3,4,5,6, מנגנוני תיקון DNA במצעים נוקלאוזומליים עדיין לא הוגדרו. חשיפת הפרטים המולקולריים העומדים בבסיס תיקון הדנ”א בכרומטין תדרוש אפיון מבני של המרכיבים המשתתפים כדי להבין כיצד תכונות מבניות מקומיות של NCP מווסתות את פעילויות תיקון הדנ”א. זה חשוב במיוחד בהקשר של תיקון כריתת בסיס (BER) בהתחשב בכך שמחקרים ביוכימיים עם אנזימי BER מציעים מנגנוני תיקון DNA ייחודיים בנוקלאוזומים התלויים בדרישות מבניות ספציפיות לאנזים לקטליזה ובמיקום המבני של נגע ה- DNA בתוך הנוקלאוזום: 7,8,9,10,11,12,13 . בהתחשב בכך ש-BER הוא תהליך חיוני לתיקון DNA, יש עניין רב למלא פערים אלה תוך יצירת נקודת מוצא שממנה ניתן לבצע מחקרים מבניים אפשריים מבחינה טכנית אחרים הכוללים קומפלקסים נוקלאוזומליים רלוונטיים.
Cryo-EM הופכת במהירות לשיטת הבחירה לפתרון המבנה התלת מימדי (3D) של קומפלקסים שההכנה בקנה מידה גדול של מדגם הומוגני מאתגרת. אמנם, התכנון והטיהור של NCPs מורכבים עם גורם תיקון DNA (NCP-DRF) ככל הנראה ידרוש אופטימיזציה מותאמת, ההליך המוצג כאן כדי ליצור ולהקפיא קומפלקס NCP-DRF יציב מספק פרטים על איך לייעל את הדגימה ואת הכנת רשת cryo-EM. שתי זרימות עבודה (שאינן סותרות זו את זו) המוצגות באיור 1, והפרטים הספציפיים בפרוטוקול מזהים שלבים קריטיים ומספקים אסטרטגיות למיטוב שלבים אלה. עבודה זו תניע את תחום תיקון הכרומטין והדנ”א לכיוון שבו השלמת מחקרים ביוכימיים עם מחקרים מבניים הופכת לאפשרית מבחינה טכנית כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים של תיקון דנ”א נוקלאוזומי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול ספציפי לטיהור גורם תיקון ה- DNA יהיה תלוי באנזים המעניין. עם זאת, ישנן כמה המלצות כלליות, כולל שימוש בשיטות רקומביננטיות לביטוי וטיהור חלבונים18; אם החלבון המעניין קטן מדי (<50 kDa), קביעת המבנה על ידי cryo-EM הייתה כמעט בלתי אפשרית עד לאחרונה באמצעות שימוש במערכות היתוך<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר מריו בורגניה מליבת cryo-EM במכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה ולד”ר ג’ושוע שטראוס מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ’אפל היל על ההדרכה וההכשרה שלהם בהכנת רשת cryo-EM. אנו מודים גם לד”ר Juliana Mello Da Fonseca Rezende על הסיוע הטכני בשלבים הראשונים של פרויקט זה. אנו מעריכים את תרומתם ותמיכתם העיקרית של ד”ר סמואל וילסון המנוח וחברי מעבדתו, במיוחד ד”ר רג’נדרה פראסאד וד”ר ג’ונאס ג’מסן לטיהור קומפלקס APE1-Polβ המאוחה גנטית. המחקר נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה [מספרי מענק Z01ES050158, Z01ES050159 ו- K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
