Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica
Summary
Questo protocollo delinea in dettaglio la preparazione di complessi nucleosomiali utilizzando due metodi di preparazione del campione per il congelamento delle griglie TEM.
Abstract
La riparazione del DNA nel contesto della cromatina è poco conosciuta. Studi biochimici che utilizzano particelle nucleosomiche del nucleosoma, l’unità ripetitiva fondamentale della cromatina, mostrano che la maggior parte degli enzimi di riparazione del DNA rimuove il danno al DNA a tassi ridotti rispetto al DNA libero. I dettagli molecolari su come gli enzimi di riparazione dell’escissione di base (BER) riconoscono e rimuovono il danno al DNA nei nucleosomi non sono stati chiariti. Tuttavia, i dati biochimici BER dei substrati nucleosomiali suggeriscono che il nucleosoma presenta diverse barriere strutturali a seconda della posizione della lesione del DNA e dell’enzima. Ciò indica che i meccanismi impiegati da questi enzimi per rimuovere il danno al DNA nel DNA libero possono essere diversi da quelli impiegati nei nucleosomi. Dato che la maggior parte del DNA genomico è assemblato in nucleosomi, sono necessarie informazioni strutturali di questi complessi. Ad oggi, la comunità scientifica manca di protocolli dettagliati per eseguire studi strutturali tecnicamente fattibili di questi complessi. Qui, forniamo due metodi per preparare un complesso di due enzimi BER geneticamente fusi (polimerasi β e AP Endonucleasi1) legati a un gap a singolo nucleotide vicino all’entrata-uscita del nucleosoma per la determinazione strutturale della crio-microscopia elettronica (crio-EM). Entrambi i metodi di preparazione del campione sono compatibili per la vetrificazione di griglie di qualità tramite congelamento a tuffo. Questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per preparare altri complessi nucleosomiali con diversi fattori BER, fattori di trascrizione pionieristici ed enzimi modificanti la cromatina.
Introduction
Il DNA eucariotico è organizzato e compattato dalle proteine istoniche, formando la cromatina. La particella nucleosomica (NCP) costituisce l’unità ripetitiva fondamentale della cromatina che regola l’accessibilità alle proteine leganti il DNA per la riparazione, la trascrizione e la replicazione del DNA1. Sebbene la prima struttura cristallina a raggi X del PCN sia stata risolta per la prima volta più di due decenni fa2 e molte altre strutture del PCN siano state pubblicate da 3,4,5,6, i meccanismi di riparazione del DNA nei substrati nucleosomiali non sono ancora stati delineati. Scoprire i dettagli molecolari alla base della riparazione del DNA nella cromatina richiederà la caratterizzazione strutturale dei componenti partecipanti per comprendere come le caratteristiche strutturali locali del PCN regolano le attività di riparazione del DNA. Ciò è particolarmente importante nel contesto della riparazione per escissione di base (BER), dato che gli studi biochimici con enzimi BER suggeriscono meccanismi unici di riparazione del DNA nei nucleosomi che dipendono dai requisiti strutturali enzimatici specifici per la catalisi e dalla posizione strutturale della lesione del DNA all’interno del nucleosoma 7,8,9,10,11,12,13 . Dato che il BER è un processo vitale di riparazione del DNA, vi è un notevole interesse a colmare queste lacune, stabilendo al contempo un punto di partenza da cui possono essere condotti altri studi strutturali tecnicamente fattibili che coinvolgono complessi nucleosomiali rilevanti.
Cryo-EM sta rapidamente diventando il metodo di scelta per risolvere la struttura tridimensionale (3D) di complessi la cui preparazione su larga scala di campioni omogenei è impegnativa. Sebbene la progettazione e la purificazione di NCP complessati con un fattore di riparazione del DNA (NCP-DRF) richiedano probabilmente un’ottimizzazione su misura, la procedura qui presentata per generare e congelare un complesso NCP-DRF stabile fornisce dettagli su come ottimizzare il campione e la preparazione della griglia crio-EM. Due flussi di lavoro (non mutuamente esclusivi) illustrati nella Figura 1 e i dettagli specifici nel protocollo identificano i passaggi critici e forniscono strategie per l’ottimizzazione di tali passaggi. Questo lavoro spingerà il campo della cromatina e della riparazione del DNA in una direzione in cui l’integrazione degli studi biochimici con quelli strutturali diventa tecnicamente fattibile per comprendere meglio i meccanismi molecolari della riparazione nucleosomica del DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocollo specifico per purificare il fattore di riparazione del DNA dipenderà dall’enzima di interesse. Tuttavia, ci sono alcune raccomandazioni generali, tra cui l’uso di metodi ricombinanti per l’espressione e la purificazione delle proteine18; se la proteina di interesse è troppo piccola (<50 kDa), la determinazione della struttura da parte della crio-EM era stata quasi impossibile fino a tempi più recenti attraverso l'uso di sistemi di fusione19, scaffold legant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Mario Borgnia del nucleo crio-EM presso il National Institute of Environmental Health Sciences e il Dr. Joshua Strauss dell’Università della Carolina del Nord a Chapel Hill per il loro tutoraggio e formazione nella preparazione della griglia crio-EM. Ringraziamo anche la Dott.ssa Juliana Mello Da Fonseca Rezende per l’assistenza tecnica nelle fasi iniziali di questo progetto. Apprezziamo il contributo chiave e il supporto del defunto Dr. Samuel H. Wilson e dei suoi membri del laboratorio, in particolare il Dr. Rajendra Prasad e il Dr. Joonas Jamsen per la purificazione del complesso APE1-Polβ geneticamente fuso. La ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [numeri di sovvenzione Z01ES050158, Z01ES050159 e K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
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