Summary

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Herstellung von Nukleosomalkomplexen unter Verwendung von zwei Methoden der Probenvorbereitung zum Einfrieren von TEM-Gittern.

Abstract

Die DNA-Reparatur im Zusammenhang mit Chromatin ist kaum verstanden. Biochemische Studien mit Nukleosomenkernpartikeln, der grundlegenden Wiederholungseinheit des Chromatins, zeigen, dass die meisten DNA-Reparaturenzyme DNA-Schäden im Vergleich zu freier DNA mit reduzierten Raten entfernen. Die molekularen Details darüber, wie Basen-Exzisionsreparatur-Enzyme (BER) DNA-Schäden in Nukleosomen erkennen und entfernen, wurden nicht aufgeklärt. Biochemische BER-Daten von nukleosomalen Substraten deuten jedoch darauf hin, dass das Nukleosom je nach Ort der DNA-Läsion und des Enzyms unterschiedliche strukturelle Barrieren aufweist. Dies deutet darauf hin, dass die Mechanismen, die von diesen Enzymen verwendet werden, um DNA-Schäden in freier DNA zu entfernen, sich von denen unterscheiden können, die in Nukleosomen verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass der Großteil der genomischen DNA zu Nukleosomen zusammengesetzt ist, werden strukturelle Informationen dieser Komplexe benötigt. Bis heute fehlen der wissenschaftlichen Gemeinschaft detaillierte Protokolle, um technisch machbare Strukturstudien dieser Komplexe durchzuführen. Hier stellen wir zwei Methoden zur Verfügung, um einen Komplex aus zwei genetisch fusionierten BER-Enzymen (Polymerase β und AP Endonuclease1) herzustellen, die an eine Einzelnukleotidlücke in der Nähe des Eintritts-Austritts des Nukleosoms gebunden sind, um die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu ermöglichen. Beide Methoden der Probenvorbereitung sind für die Verglasung von Qualitätsgittern durch Tauchgefrieren geeignet. Dieses Protokoll kann als Ausgangspunkt für die Herstellung anderer nukleosomaler Komplexe mit verschiedenen BER-Faktoren, Pionier-Transkriptionsfaktoren und Chromatin-modifizierenden Enzymen verwendet werden.

Introduction

Eukaryotische DNA wird durch Histonproteine organisiert und verdichtet, wobei Chromatin gebildet wird. Das Nukleosomenkernpartikel (NCP) stellt die grundlegende Wiederholungseinheit des Chromatins dar, die den Zugang zu DNA-bindenden Proteinen für die DNA-Reparatur, -Transkription und -Replikation reguliert1. Obwohl die erste Röntgenkristallstruktur des NCP erstmals vor mehr als zwei Jahrzehnten aufgeklärt wurde2 und viele weitere Strukturen des NCP seit 3,4,5,6 veröffentlicht wurden, sind DNA-Reparaturmechanismen in nukleosomalen Substraten noch nicht beschrieben. Die Aufdeckung der molekularen Details, die der DNA-Reparatur im Chromatin zugrunde liegen, erfordert eine strukturelle Charakterisierung der beteiligten Komponenten, um zu verstehen, wie lokale strukturelle Merkmale des NCP die DNA-Reparaturaktivitäten regulieren. Dies ist besonders wichtig im Zusammenhang mit der Basenexzisionsreparatur (BER), da biochemische Studien mit BER-Enzymen auf einzigartige DNA-Reparaturmechanismen in Nukleosomen hindeuten, die von enzymspezifischen strukturellen Anforderungen für die Katalyse und der strukturellen Position der DNA-Läsion innerhalb des Nukleosomsabhängen 7,8,9,10,11,12,13 . Da es sich bei der BER um einen lebenswichtigen DNA-Reparaturprozess handelt, besteht ein erhebliches Interesse, diese Lücken zu schließen und gleichzeitig einen Ausgangspunkt zu schaffen, von dem aus andere technisch realisierbare Strukturstudien mit relevanten nukleosomalen Komplexen durchgeführt werden können.

Die Kryo-EM entwickelt sich schnell zur Methode der Wahl, um die dreidimensionale (3D) Struktur von Komplexen zu lösen, deren großflächige Vorbereitung einer homogenen Probe eine Herausforderung darstellt. Obwohl das Design und die Aufreinigung von NCPs, die mit einem DNA-Reparaturfaktor (NCP-DRF) komplexiert sind, wahrscheinlich eine maßgeschneiderte Optimierung erfordern wird, liefert das hier vorgestellte Verfahren zur Erzeugung und zum Einfrieren eines stabilen NCP-DRF-Komplexes Details zur Optimierung der Proben- und Kryo-EM-Gittervorbereitung. Zwei (sich nicht gegenseitig ausschließende) Workflows, die in Abbildung 1 dargestellt sind, und die spezifischen Details im Protokoll identifizieren kritische Schritte und bieten Strategien zur Optimierung dieser Schritte. Diese Arbeit wird das Chromatin- und DNA-Reparaturfeld in eine Richtung treiben, in der die Ergänzung biochemischer mit strukturellen Studien technisch möglich wird, um die molekularen Mechanismen der nukleosomalen DNA-Reparatur besser zu verstehen.

Protocol

1. Zusammenbau von Nukleosomenkernpartikeln mittels Salz-Garstoff-Dialyse ANMERKUNG: Die Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln unter Verwendung rekombinanter Histonproteine für Strukturstudien wurde von anderen ausführlich beschrieben14,15,16. Befolgen Sie die Reinigung der rekombinanten X. laevis-Histone und der Histon-Oktamer-Assemblierung, die von anderen<sup class="xre…

Representative Results

Richtig zusammengesetzte NCPs (Abbildung 2) wurden verwendet, um einen Komplex mit einem rekombinanten Fusionsprotein aus MBP-Polβ-APE1 herzustellen (Abbildung 3). Um das Verhältnis von NCP zu MBP-Polβ-APE1 zur Bildung eines stabilen Komplexes zu bestimmen, führten wir elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) durch (Abbildung 4), die eine einfach verschobene Bande des NCP mit einem 5-fachen molaren Überschuss an…

Discussion

Ein spezifisches Protokoll zur Reinigung des DNA-Reparaturfaktors hängt von dem interessierenden Enzym ab. Es gibt jedoch einige allgemeine Empfehlungen, einschließlich der Verwendung rekombinanter Methoden zur Proteinexpression und -reinigung18; Wenn das interessierende Protein zu klein ist (<50 kDa), war die Strukturbestimmung durch Kryo-EM bis vor kurzem durch den Einsatz von Fusionssystemen19, Nanokörper-bindenden Gerüsten20 und der Optimieru…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Mario Borgnia vom Kryo-EM-Kern am National Institute of Environmental Health Sciences und Dr. Joshua Strauss von der University of North Carolina in Chapel Hill für ihr Mentoring und ihre Ausbildung in der Kryo-EM-Netzvorbereitung. Wir danken auch Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende für die technische Unterstützung in der Anfangsphase dieses Projekts. Wir schätzen den wichtigen Beitrag und die Unterstützung des verstorbenen Dr. Samuel H. Wilson und seiner Labormitglieder, insbesondere Dr. Rajendra Prasad und Dr. Joonas Jamsen, für die Reinigung des genetisch fusionierten APE1-Polβ-Komplexes. Die Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm der National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [Förderkennzeichen Z01ES050158, Z01ES050159 und K99ES031662-01] unterstützt.

Materials

1 M HEPES; pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15630080
1 M MgCl2 Thermo Fisher Scientific AM9530G
10x TBE Bio-rad 1610733
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
3 M KCl Thermo Fisher Scientific 043398.K2
491 prep cell Bio-rad 1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma UFC8030
AutoGrid Tweezers Ted Pella 47000-600
Automatic Plunge Freezer Leica Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler Bio-rad 1851148
C-clips and rings Thermo Fisher 6640–6640
Clipping station SubAngostrom SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) Fisher Scientific 15370752
Diamond Tweezers Techni-Pro 758TW0010
dsDNA Integrated DNA techonologies N/A
FEI Titan Krios Thermo Fisher KRIOSG4TEM
FPLC purification system AKTA Pure 29018224
Fraction collector Model 2110 Bio-rad 7318122
Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S
Grid Boxes SubAngostrom PB-E
Grid Storage Accessory Pack SubAngostrom GSAX
Liquid Ethane N/A N/A
Liquid Nitrogen N/A N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump Gilson F155008
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels Thermo Fisher Scientific EC6695BOX
Pipetman Gilson FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention VWR 76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1) Bio-rad 1610158
polyethylene glycol (PEG) Millipore Sigma P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500 Millipore Sigma PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor N/A N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids Quantifoil N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer N/A N/A
Spring clipping tools SubAngostrom CSA-01
Superdex 200 column 10/300 Millipore Sigma GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope Thermo Fisher Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I Ted Pella 47000-500
UltraPure Glycerol Thermo Fisher Scientific 15514011
Vitrobot Thermo Fisher Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM) Cytiva 1005-055
Xylene cyanol Thermo Fisher Scientific 440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL Thermo Fisher Scientific 89877

References

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Rodriguez, Y., Butay, K. J., Sharma, K., Viverette, E., Wilson, S. H. Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination. J. Vis. Exp. (186), e64061, doi:10.3791/64061 (2022).

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