Получение частиц ядра нуклеосом в комплексе с факторами репарации ДНК для определения структуры криоэлектронной микроскопии
Summary
В настоящем протоколе подробно описывается подготовка нуклеосомных комплексов с использованием двух методов пробоподготовки для замораживания сеток ПЭМ.
Abstract
Репарация ДНК в контексте хроматина плохо изучена. Биохимические исследования с использованием частиц ядра нуклеосом, фундаментальной повторяющейся единицы хроматина, показывают, что большинство ферментов репарации ДНК удаляют повреждение ДНК с меньшей скоростью по сравнению со свободной ДНК. Молекулярные детали того, как ферменты эксцизионной репарации оснований (BER) распознают и удаляют повреждения ДНК в нуклеосомах, не были выяснены. Однако биохимические данные BER нуклеосомных субстратов свидетельствуют о том, что нуклеосома представляет различные структурные барьеры в зависимости от местоположения поражения ДНК и фермента. Это указывает на то, что механизмы, используемые этими ферментами для удаления повреждений ДНК в свободной ДНК, могут отличаться от тех, которые используются в нуклеосомах. Учитывая, что большая часть геномной ДНК собрана в нуклеосомы, необходима структурная информация этих комплексов. На сегодняшний день научному сообществу не хватает подробных протоколов для выполнения технически осуществимых структурных исследований этих комплексов. Здесь мы предлагаем два метода получения комплекса из двух генетически слитых ферментов BER (полимераза β и эндонуклеаза AP1), связанных с однонуклеотидным промежутком вблизи входа-выхода нуклеосомы для структурного определения с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Оба метода пробоподготовки совместимы для остекловывания качественных решеток методом погружной заморозки. Этот протокол может быть использован в качестве отправной точки для получения других нуклеосомных комплексов с различными факторами BER, пионерными факторами транскрипции и ферментами, модифицирующими хроматин.
Introduction
Эукариотическая ДНК организована и уплотнена гистоновыми белками, образуя хроматин. Ядро нуклеосомы (NCP) представляет собой фундаментальную повторяющуюся единицу хроматина, которая регулирует доступность ДНК-связывающих белков для репарации ДНК, транскрипции и репликации1. Хотя первая рентгеновская кристаллическая структура NCP была впервые решена более двух десятилетий назад2 и многие другие структуры NCP были опубликованы с 3,4,5,6, механизмы репарации ДНК в нуклеосомных субстратах еще не очерчены. Раскрытие молекулярных деталей, лежащих в основе репарации ДНК в хроматине, потребует структурной характеристики участвующих компонентов, чтобы понять, как локальные структурные особенности NCP регулируют активность репарации ДНК. Это особенно важно в контексте эксцизионной репарации оснований (BER), учитывая, что биохимические исследования с ферментами BER предполагают уникальные механизмы репарации ДНК в нуклеосомах, которые зависят от специфических для фермента структурных требований для катализа и структурного положения поражения ДНК в нуклеосоме 7,8,9,10,11,12,13 . Учитывая, что BER является жизненно важным процессом репарации ДНК, существует значительный интерес к заполнению этих пробелов, а также к созданию отправной точки, с которой могут быть проведены другие технически осуществимые структурные исследования с участием соответствующих нуклеосомных комплексов.
Крио-ЭМ быстро становится предпочтительным методом для решения трехмерной (3D) структуры комплексов, крупномасштабная подготовка которых однородного образца является сложной задачей. Несмотря на то, что проектирование и очистка NCP в комплексе с фактором репарации ДНК (NCP-DRF), вероятно, потребует индивидуальной оптимизации, представленная здесь процедура создания и замораживания стабильного комплекса NCP-DRF предоставляет подробную информацию о том, как оптимизировать подготовку образца и крио-ЭМ-сетки. Два рабочих процесса (не взаимоисключающие), показанные на рисунке 1, и конкретные детали в протоколе определяют критические шаги и предоставляют стратегии для их оптимизации. Эта работа продвинет область репарации хроматина и ДНК в направлении, где дополнение биохимических исследований структурными исследованиями станет технически возможным для лучшего понимания молекулярных механизмов нуклеосомной репарации ДНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Конкретный протокол очистки фактора репарации ДНК будет зависеть от интересующего фермента. Тем не менее, существуют некоторые общие рекомендации, включая использование рекомбинантных методов экспрессии и очистки белка18; если интересующий белок слишком мал (<50 кДа), опре?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Марио Боргнию из крио-ЭМ-ядра Национального института наук об окружающей среде и доктора Джошуа Штрауса из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл за их наставничество и обучение подготовке крио-ЭМ-сетки. Мы также благодарим д-ра Джулиану Мелло да Фонсеку Резенде за техническую помощь на начальных этапах этого проекта. Мы высоко ценим ключевой вклад и поддержку покойного доктора Сэмюэля Х. Уилсона и членов его лаборатории, особенно доктора Раджендры Прасада и доктора Йоонаса Джамсена в очистке генетически слитого комплекса APE1-Polβ. Исследования были поддержаны Программой внутренних исследований Национальных институтов здравоохранения, Национального института наук об окружающей среде [номера грантов Z01ES050158, Z01ES050159 и K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
