クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製
Summary
このプロトコルは、TEMグリッドを凍結するためのサンプル調製の2つの方法を使用したヌクレオソーム複合体の調製について詳細に概説しています。
Abstract
クロマチンの文脈でのDNA修復はよく理解されていません。クロマチンの基本繰り返し単位であるヌクレオソームコア粒子を用いた生化学的研究では、ほとんどのDNA修復酵素が遊離DNAと比較してDNA損傷を減少した速度で除去することが示されています。塩基除去修復(BER)酵素がヌクレオソームのDNA損傷をどのように認識して除去するかについての分子の詳細は解明されていません。しかし、ヌクレオソーム基質の生化学的BERデータは、ヌクレオソームがDNA病変の位置と酵素に応じて異なる構造障壁を提示することを示唆しています。これは、遊離DNAのDNA損傷を除去するためにこれらの酵素によって使用されるメカニズムが、ヌクレオソームで採用されているメカニズムとは異なる可能性があることを示しています。ゲノムDNAの大部分がヌクレオソームに集合していることを考えると、これらの複合体の構造情報が必要です。今日まで、科学界はこれらの複合体の技術的に実行可能な構造研究を実行するための詳細なプロトコルを欠いています。ここでは、クライオ電子顕微鏡(クライオEM)構造決定のために、ヌクレオソームの出入り付近の一塩基ギャップに結合した2つの遺伝子融合BER酵素(ポリメラーゼβとAPエンドヌクレアーゼ1)の複合体を調製する2つの方法を提供します。どちらのサンプル調製方法も、プランジ凍結 による 品質グリッドのガラス化に対応しています。このプロトコルは、異なるBER因子、パイオニア転写因子、およびクロマチン修飾酵素を有する他のヌクレオソーム複合体を調製するための出発点として使用できます。
Introduction
真核生物のDNAはヒストンタンパク質によって組織化および圧縮され、クロマチンを形成します。ヌクレオソームコア粒子(NCP)は、DNA修復、転写、および複製のためのDNA結合タンパク質へのアクセスを調節するクロマチンの基本的な繰り返し単位を構成します1。NCPの最初のX線結晶構造は20年以上前に最初に解決され2、3,4,5,6以降、NCPの構造はさらに多くのものが発表されていますが、ヌクレオソーム基質のDNA修復メカニズムはまだ解明されていません。クロマチンのDNA修復の根底にある分子の詳細を明らかにするには、NCPの局所的な構造的特徴がDNA修復活性をどのように調節しているかを理解するために、関与する成分の構造特性評価が必要です。BER酵素を用いた生化学的研究により、触媒作用のための酵素特異的構造要件およびヌクレオソーム内のDNA病変の構造位置に依存するヌクレオソーム内のユニークなDNA修復メカニズムが示唆されていることを考えると、これは塩基除去修復(BER)の文脈において特に重要である7,8,9,10,11,12,13。.BERが重要なDNA修復プロセスであることを考えると、これらのギャップを埋めると同時に、関連するヌクレオソーム複合体を含む他の技術的に実行可能な構造研究を実施できる出発点を確立することにかなりの関心があります。
クライオ電子顕微鏡は、均質なサンプルの大規模な調製が困難な複合体の3次元(3D)構造を解くための選択方法に急速になりつつあります。DNA修復因子(NCP-DRF)と複合体を形成したNCPの設計と精製には、カスタマイズされた最適化が必要になる可能性がありますが、安定したNCP-DRF複合体を生成および凍結するためのここで紹介する手順では、サンプルとクライオEMグリッド調製を最適化する方法の詳細を説明します。 図 1 に示す 2 つのワークフロー (相互に排他的ではありません) とプロトコルの具体的な詳細は、重要なステップを識別し、これらのステップを最適化するための戦略を提供します。この研究は、ヌクレオソームDNA修復の分子メカニズムをよりよく理解するために、構造研究で生化学的に補完することが技術的に実現可能になる方向にクロマチンとDNA修復分野を推進します。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA修復因子を精製するための特定のプロトコルは、目的の酵素に依存するであろう。ただし、タンパク質の発現と精製のための組換え法の使用など、いくつかの一般的な推奨事項があります18。目的のタンパク質が小さすぎる(<50 kDa)場合、クライオEMによる構造決定は、融合システム19、ナノボディ結合足場20、およびイメージング戦略の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国立環境衛生科学研究所のクライオEMコアのマリオ・ボルニア博士とノースカロライナ大学チャペルヒル校のジョシュア・ストラウス博士のクライオEMグリッド準備の指導とトレーニングに感謝します。また、このプロジェクトの初期段階での技術支援を提供してくれたジュリアナ・メロ・ダ・フォンセカ・レゼンデ博士にも感謝します。故サミュエル・H・ウィルソン博士と彼の研究室メンバー、特にラジェンドラ・プラサド博士とヨーナス・ジャムセン博士の遺伝的融合APE1-Polβ複合体の精製に対する重要な貢献と支援に感謝します。国立衛生研究所 国立環境衛生研究所 学内研究プログラム[課題番号 Z01ES050158, Z01ES050159, K99ES031662-01]の支援を受けています。
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
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