In Vitro Kalsiyum Birikimini Ölçmek için Yarı Otomatik ve Tekrarlanabilir Biyolojik Tabanlı Bir Yöntem
Summary
Kardiyovasküler hastalık dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Vasküler kalsifikasyon kardiyovasküler morbidite ve mortalite yüküne önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu protokol, floresan görüntüleme ile vasküler düz kas hücresi aracılı kalsiyum çökelmesini in vitro olarak ölçmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Vasküler kalsifikasyon, inflamasyon, hücresel fenotipteki değişiklikler, hücre ölümü ve kalsifikasyon inhibitörlerinin yokluğu da dahil olmak üzere bir dizi dejeneratif patolojiyi içerir ve bu da eşzamanlı olarak damar elastikiyeti ve fonksiyon kaybına yol açar. Vasküler kalsifikasyon, kronik böbrek hastalığı, diabetes mellitus ve ateroskleroz gibi birçok patolojide morbidite ve mortaliteye önemli bir katkıda bulunmaktadır. Vasküler kalsifikasyonu incelemek için mevcut araştırma modelleri sınırlıdır ve sadece kalsifikasyon gelişiminin in vivo geç aşamalarında uygulanabilir. Vasküler kalsifikasyonu incelemek için in vitro araçlar, son nokta ölçümlerini kullanır, biyolojik materyal üzerindeki talepleri arttırır ve araştırma çalışmalarına değişkenliğin getirilmesini riske atar. İnsan vasküler düz kas hücreleri üzerinde in vitro kalsifikasyon gelişimine bağlanan ve in vitro kalsifikasyonun gerçek zamanlı gelişimini belirleyen yeni bir floresan etiketli probun uygulanmasını gösteriyoruz. Bu protokolde, potansiyel translasyonel uygulamaları olan hastalık modellemesinde yeni bir araç olan yeni geliştirilen kalsifikasyon testimizin uygulanmasını açıklıyoruz. Bu tahlilin, kemik, kıkırdak veya diş araştırmalarındaki uygulamalar da dahil olmak üzere daha geniş bir mineral biriktirme araştırması yelpazesinde alakalı olmasını öngörüyoruz.
Introduction
Vasküler kalsifikasyon (VC) kardiyovasküler morbidite ve mortalite için bağımsız bir risk faktörüdür 1,2,3. Uzun zamandır ektopik mineral birikiminin pasif bir kimyasal süreci olarak kabul edilirken, şimdi hastalığın itici gücü olarak aktif vasküler düz kas hücreleri (hVSMC) dahil olmak üzere çeşitli hücrelerin aktif katkısını içeren değiştirilebilir bir doku iyileşme yanıtı ortaya çıkmaktadır 4,5. İn vivo VC, aterosklerotik yükündeğerlendirilmesi olarak çok kesitli BT taramaları ile ölçülebilir 6,7,8. Şu anda, VC şiddetinin kardiyovasküler hastalık, tip II diyabet, kronik böbrek hastalığı ve yaşlanma 9,10,11,12,13,14,15’te bir risk faktörü olarak kabul edildiği bir paradigma değişimi devam etmektedir.
hVSMC’ler kardiyovasküler sistemde en bol bulunan hücre tipidir ve VC gelişiminde başlıca aktördür. İn vitro hVSMC kaynaklı kalsifikasyon, kardiyovasküler hastalıkları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir hastalık modelidir16,17. Bununla birlikte, in vitro kalsifikasyonun tespiti için çoğu protokol, veri toplamayı sınırlayabilen, hücresel materyalin daha fazla kullanılmasını gerektiren ve araştırmayı yavaşlatabilen son nokta ölçümlerini kullanır. İn vitro hVSMC kalsifikasyonunun tespiti için yaygın yöntemler, toplam proteine karşı çözünür kalsiyum birikimini ölçen ve hücre lizisi18 gerektiren o-cresolphthalein testini içerir. Ayrıca, sabit hücreler veya doku19 üzerindeki kalsiyum birikintilerine doğrudan bağlanan Alizarin Kırmızı boyama kullanılır. Zaman içinde hVSMC kalsifikasyonunu o-kresolftalin veya Alizarin Kırmızısı ile incelemek için, zaman noktası başına replika partileri gerekir, bu da biyolojik materyale olan talebi arttırır ve sırayla değişkenlik şansını arttırır.
Bu yazıda, in vitro VC progresyonunu belirlemek ve tekil bir son aşama kalsifikasyon testi olarak işlev görmek için floresan görüntüleme probu ile hVSMC’leri kullanan yeni bir tahlilin uygulama yöntemini detaylandırıyoruz. Daha önce bu tahlilin o-cresolphthalein ve Alizarin Red yöntemleriyle doğrudan karşılaştırılabilir olduğunu ve değişen kültür koşullarını ayırt etmek için kullanılabileceğini göstermiştik20. Gerçek zamanlı ölçümlere ek olarak, bu tahlil, klinik VC gelişimi için vekil bir belirteç olarak serum veya plazma örneklerinin eğilimini belirlemek için kullanılabilir20. Bu, kardiyovasküler bilimlerin biyolojik stratejilerinin ve hastalık modellemesinin uygulanmasına yardımcı olacaktır. Tahlilin başka bir uygulaması, VC şiddetini veya serum veya plazma gibi kan bileşenlerinden ilerlemeyi değerlendirmek için translasyonel bir BioHybrid sistemi olarak olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, in vitro kalsifikasyon tayini için yarı otomatik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem için, hVSMC kalsifikasyonunun üç kritik adımı optimize edilmelidir. İlk olarak, hücresel yoğunluk hVSMC kalsifikasyon gelişimi için kritik öneme sahiptir. Düşük hVSMC yoğunlukları, hücreden hücreye temasın olmaması ve kalsifikasyon koşulları altında indüklenen stres nedeniyle yavaş veya hiç kalsifikasyon ve hücre ölümü ile sonuçlanacaktır21. Yüksek hü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Avrupa Birliği’nin Marie Sklodowska-Curie hibe anlaşması No 722609 ve 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007) kapsamındaki Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programları tarafından finanse edilmiştir. Bu araştırma BioSPX tarafından desteklenmiştir. WJ-D, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) TRR219 proje kimliği 322900939 ve proje kimliği 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
