Een semi-geautomatiseerde en reproduceerbare biologische methode om calciumdepositie in vitro te kwantificeren
Summary
Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Vasculaire verkalking draagt substantieel bij aan de last van cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om vasculaire gladde spiercel-gemedieerde calciumprecipitatie in vitro te kwantificeren door fluorescentie beeldvorming.
Abstract
Vasculaire verkalking omvat een reeks degeneratieve pathologieën, waaronder ontsteking, veranderingen in cellulair fenotype, celdood en de afwezigheid van verkalkingsremmers, die tegelijkertijd leiden tot een verlies van vaatelasticiteit en functie. Vasculaire verkalking is een belangrijke bijdrage aan morbiditeit en mortaliteit in veel pathologieën, waaronder chronische nierziekte, diabetes mellitus en atherosclerose. De huidige onderzoeksmodellen om vasculaire verkalking te bestuderen zijn beperkt en zijn alleen levensvatbaar in de late stadia van de ontwikkeling van calcificatie in vivo. In vitro hulpmiddelen voor het bestuderen van vasculaire verkalking maken gebruik van eindpuntmetingen, waardoor de eisen aan biologisch materiaal toenemen en de introductie van variabiliteit in onderzoeksstudies riskeert. We demonstreren de toepassing van een nieuwe fluorescerend gelabelde sonde die zich bindt aan in vitro verkalkingsontwikkeling op menselijke vasculaire gladde spiercellen en de real-time ontwikkeling van in vitro verkalking bepaalt. In dit protocol beschrijven we de toepassing van onze nieuw ontwikkelde verkalkingstest, een nieuw hulpmiddel in ziektemodellering dat potentiële translationele toepassingen heeft. We denken dat deze test relevant is in een breder spectrum van mineraaldepositieonderzoek, inclusief toepassingen in bot-, kraakbeen- of tandheelkundig onderzoek.
Introduction
Vasculaire verkalking (VC) is een onafhankelijke risicofactor voor cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit 1,2,3. Lang beschouwd als een passief chemisch proces van ectopische minerale afzetting, lijkt het nu een aanpasbare weefselgenezingsrespons met de actieve bijdrage van verschillende cellen, waaronder geactiveerde vasculaire gladde spiercellen (hVSMC) als een aanjager van de ziekte 4,5. In vivo VC kan worden gemeten door multislice CT-scans als een beoordeling van atherosclerotische belasting 6,7,8. Momenteel is er een paradigmaverschuiving aan de gang, waarbij de ernst van VC wordt erkend als een risicofactor bij hart- en vaatziekten, diabetes type II, chronische nierziekte en veroudering 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC’s zijn het meest voorkomende celtype in het cardiovasculaire systeem en een belangrijke actor in de ontwikkeling van VC. In vitro hVSMC-geïnduceerde verkalking is een veelgebruikt ziektemodel om hart- en vaatziekten te bestuderen16,17. De meeste protocollen voor de detectie van in vitro verkalking maken echter gebruik van eindpuntmetingen die data-acquisitie kunnen beperken, meer gebruik van cellulair materiaal vereisen en onderzoek kunnen vertragen. Veelgebruikte methoden voor de detectie van in vitro hVSMC-verkalking omvatten de o-cresolphthaleïne-assay, die opgeloste calciumafzetting meet tegen totaal eiwit en cellyse vereist18. Ook wordt Alizarine Rode kleuring gebruikt, die zich rechtstreeks bindt aan calciumafzettingen op vaste cellen of weefsel19. Om hVSMC-verkalking in de loop van de tijd te bestuderen met o-cresolphthaleïne of Alizarin Red, zijn batches van replicaties per tijdspunt vereist, waardoor de vraag naar biologisch materiaal toeneemt en op zijn beurt de kans op variabiliteit toeneemt.
In dit artikel beschrijven we de methode voor de toepassing van een nieuwe test die hVSMC’s gebruikt met een fluorescerende beeldvormingsonde om in vitro VC-progressie te bepalen en te functioneren als een enkelvoudige eindstadiumverkalkingstest. We hebben eerder aangetoond dat deze test direct vergelijkbaar is met de o-cresolphthaleïne en Alizarin Red-methoden en kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen verschillende kweekomstandigheden20. Naast real-time metingen kan deze test worden gebruikt om de neiging van serum- of plasmamonsters te bepalen als surrogaatmarker voor klinische VC-ontwikkeling20. Dit zal helpen bij de toepassing van biologische strategieën van cardiovasculaire wetenschappen en ziektemodellering. Een verdere toepassing van de test kan zijn als een translationeel BioHybrid-systeem om de ernst of progressie van VC van bloedbestanddelen zoals serum of plasma te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een semi-geautomatiseerde methode voor in vitro verkalkingsbepaling. Voor deze methode moeten drie kritieke stappen van hVSMC-verkalking worden geoptimaliseerd. Ten eerste is cellulaire dichtheid van cruciaal belang voor de ontwikkeling van hVSMC-verkalking. Lage dichtheden van hVSMC’s zullen resulteren in langzame of geen verkalking en celdood als gevolg van het ontbreken van cel-tot-cel contact en de stress die wordt geïnduceerd onder verkalkende omstandigheden<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma’s van de Europese Unie onder de Marie Sklodowska-Curie subsidieovereenkomst nr. 722609 en 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Dit onderzoek werd ondersteund door BioSPX. WJ-D ontving financiering van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR219-project ID 322900939 en project ID 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
