Полуавтоматизированный и воспроизводимый биологический метод количественной оценки осаждения кальция in vitro
Summary
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире. Кальцификация сосудов вносит существенный вклад в бремя сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности. Этот протокол описывает простой метод количественной оценки осаждения кальция in vitro с помощью флуоресцентной визуализации.
Abstract
Кальцификация сосудов включает в себя ряд дегенеративных патологий, включая воспаление, изменения клеточного фенотипа, гибель клеток и отсутствие ингибиторов кальцификации, которые одновременно приводят к потере эластичности и функции сосудов. Кальцификация сосудов является важным фактором заболеваемости и смертности при многих патологиях, включая хроническое заболевание почек, сахарный диабет и атеросклероз. Современные исследовательские модели для изучения кальцификации сосудов ограничены и жизнеспособны только на поздних стадиях развития кальцификации in vivo. Инструменты in vitro для изучения кальцификации сосудов используют измерения конечных точек, повышая требования к биологическому материалу и рискуя введением изменчивости в научные исследования. Мы демонстрируем применение нового флуоресцентно меченого зонда, который связывается с развитием кальцификации in vitro на клетках гладкой мускулатуры сосудов человека и определяет развитие кальцификации in vitro в реальном времени. В этом протоколе мы описываем применение нашего недавно разработанного анализа кальцификации, нового инструмента в моделировании заболеваний, который имеет потенциальное трансляционное применение. Мы предполагаем, что этот анализ будет актуален в более широком спектре исследований минерального осаждения, включая применение в исследованиях костей, хрящей или зубов.
Introduction
Кальцификация сосудов (ВК) является самостоятельным фактором риска сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности 1,2,3. Долгое время считавшийся пассивным химическим процессом внематочного минерального отложения, теперь он представляет собой модифицируемую реакцию заживления тканей, включающую активный вклад различных клеток, включая активированные клетки гладкой мускулатуры сосудов (hVSMC) в качестве драйвера заболевания 4,5. In vivo ВК может быть измерен с помощью многоспиральной компьютерной томографии как оценка атеросклеротическойнагрузки 6,7,8. В настоящее время происходит смена парадигмы, в которой тяжесть ВК становится признанным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, диабета II типа, хронического заболевания почек и старения 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC являются наиболее распространенным типом клеток в сердечно-сосудистой системе и основным участником в развитии VC. Кальцификация in vitro hVSMC является широко используемой моделью заболевания для изучения сердечно-сосудистых заболеваний16,17. Тем не менее, большинство протоколов для обнаружения кальцификации in vitro используют измерения конечных точек, которые могут ограничить сбор данных, требуют более широкого использования клеточного материала и могут замедлить исследования. Общие методы обнаружения кальцификации hVSMC in vitro включают анализ o-кресольфталеина, который измеряет солюбилизированное отложение кальция против общего белка и требует лизиса клеток18. Также используется окрашивание Alizarin Red, которое связывается непосредственно с отложениями кальция на фиксированных клетках или ткани19. Для изучения кальцификации hVSMC с течением времени с помощью o-кресольфталеина или Alizarin Red требуются партии реплик в каждый момент времени, увеличивая спрос на биологический материал и, в свою очередь, увеличивая вероятность изменчивости.
В этой статье мы подробно описываем метод применения нового анализа, который использует hVSMC с флуоресцентным зондом визуализации для определения прогрессирования VC in vitro , а также функционирует как сингулярный анализ кальцификации на конечной стадии. Ранее мы продемонстрировали, что этот анализ непосредственно сопоставим с методами o-cresolphthalein и Alizarin Red и может быть использован для различения различных условий культуры20. В дополнение к измерениям в режиме реального времени этот анализ может быть использован для определения склонности образцов сыворотки или плазмы в качестве суррогатного маркера для клинической разработки VC20. Это поможет в применении биологических стратегий сердечно-сосудистых наук и моделировании заболеваний. Дальнейшее применение анализа может осуществляться в виде трансляционной системы BioHybrid для оценки тяжести или прогрессирования VC из компонентов крови, таких как сыворотка или плазма.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы описываем полуавтоматический метод определения кальцификации in vitro . Для этого метода необходимо оптимизировать три критических этапа кальцификации hVSMC. Во-первых, клеточная плотность имеет решающее значение для развития кальцификации hVSMC. Низкая плотность hVSMC ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось исследовательскими и инновационными программами Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 722609 и 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Это исследование было поддержано BioSPX. WJ-D получил финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) TRR219 -проект ID 322900939 и проект ID 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
