Un metodo semi-automatico e riproducibile a base biologica per quantificare la deposizione di calcio in vitro
Summary
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo. La calcificazione vascolare contribuisce in modo sostanziale al carico di morbilità e mortalità cardiovascolare. Questo protocollo descrive un metodo semplice per quantificare la precipitazione di calcio mediata da cellule muscolari lisce vascolari in vitro mediante imaging fluorescente.
Abstract
La calcificazione vascolare comporta una serie di patologie degenerative, tra cui l’infiammazione, i cambiamenti del fenotipo cellulare, la morte cellulare e l’assenza di inibitori della calcificazione, che portano contemporaneamente a una perdita di elasticità e funzionalità dei vasi. La calcificazione vascolare è un importante contributo alla morbilità e alla mortalità in molte patologie, tra cui la malattia renale cronica, il diabete mellito e l’aterosclerosi. Gli attuali modelli di ricerca per studiare la calcificazione vascolare sono limitati e sono praticabili solo nelle ultime fasi dello sviluppo della calcificazione in vivo. Gli strumenti in vitro per lo studio della calcificazione vascolare utilizzano misurazioni end-point, aumentando le richieste di materiale biologico e rischiando l’introduzione di variabilità negli studi di ricerca. Dimostriamo l’applicazione di una nuova sonda marcata con fluorescenza che si lega allo sviluppo della calcificazione in vitro sulle cellule muscolari lisce vascolari umane e determina lo sviluppo in tempo reale della calcificazione in vitro . In questo protocollo, descriviamo l’applicazione del nostro test di calcificazione di nuova concezione, un nuovo strumento nella modellazione delle malattie che ha potenziali applicazioni traslazionali. Prevediamo che questo test sia rilevante in uno spettro più ampio di ricerca sulla deposizione minerale, comprese le applicazioni nelle ossa, nella cartilagine o nella ricerca dentale.
Introduction
La calcificazione vascolare (VC) è un fattore di rischio indipendente per la morbilità e mortalità cardiovascolare 1,2,3. A lungo considerato un processo chimico passivo di deposizione di minerali ectopici, ora appare una risposta di guarigione tissutale modificabile che coinvolge il contributo attivo di varie cellule tra cui le cellule muscolari lisce vascolari attivate (hVSMC) come driver della malattia 4,5. In vivo La VC può essere misurata mediante TAC multislice come valutazione del carico aterosclerotico 6,7,8. Attualmente, è in corso un cambiamento di paradigma, in cui la gravità VC viene riconosciuta come un fattore di rischio nelle malattie cardiovascolari, nel diabete di tipo II, nella malattia renale cronica e nell’invecchiamento 9,10,11,12,13,14,15.
Le hVSMC sono il tipo di cellula più abbondante nel sistema cardiovascolare e un attore principale nello sviluppo della VC. La calcificazione indotta da hVSMC in vitro è un modello di malattia ampiamente utilizzato per studiare le malattie cardiovascolari16,17. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli per il rilevamento della calcificazione in vitro utilizza misurazioni end-point che possono limitare l’acquisizione dei dati, richiedere un maggiore uso di materiale cellulare e possono rallentare la ricerca. I metodi comuni per il rilevamento della calcificazione in vitro di hVSMC includono il saggio o-cresolphthalein, che misura la deposizione di calcio solubilizzato rispetto alle proteine totali e richiede la lisi cellulare18. Inoltre, viene utilizzata la colorazione Alizarin Red, che si lega direttamente ai depositi di calcio su cellule fisse o tessuto19. Per studiare la calcificazione di hVSMC nel tempo con o-cresolphthalein o Alizarin Red richiede lotti di repliche per punto temporale, aumentando la domanda di materiale biologico e, a sua volta, aumentando la possibilità di variabilità.
In questo articolo, descriviamo in dettaglio il metodo per l’applicazione di un nuovo test che utilizza hVSMC con una sonda di imaging fluorescente per determinare la progressione VC in vitro e funzionare come un singolo test di calcificazione allo stadio terminale. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo test è direttamente paragonabile ai metodi o-cresolphthalein e Alizarin Red e può essere utilizzato per distinguere tra diverse condizioni di coltura20. Oltre alle misurazioni in tempo reale, questo test può essere utilizzato per determinare la propensione dei campioni di siero o plasma come marcatore surrogato per lo sviluppo clinico di VC20. Ciò aiuterà nell’applicazione di strategie biologiche delle scienze cardiovascolari e nella modellizzazione delle malattie. Un’ulteriore applicazione del test può essere come sistema bioibrido traslazionale per valutare la gravità o la progressione della VC da costituenti del sangue come siero o plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, descriviamo un metodo semi-automatico per la determinazione della calcificazione in vitro . Per questo metodo, è necessario ottimizzare tre fasi critiche della calcificazione di hVSMC. In primo luogo, la densità cellulare è fondamentale per lo sviluppo della calcificazione di hVSMC. Basse densità di hVSMC si tradurranno in una calcificazione lenta o assente e nella morte cellulare a causa della mancanza di contatto cellula-cellula e dello stress indotto in condizioni calcificanti<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dai programmi di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie n. 722609 e 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Questa ricerca è stata supportata da BioSPX. WJ-D ha ricevuto finanziamenti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) TRR219-ID 322900939 e ID progetto 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
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