Um método semi-automatizado e reprodutível de base biológica para quantificar a deposição de cálcio in vitro
Summary
A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. A calcificação vascular contribui substancialmente para a carga de morbidade e mortalidade cardiovascular. Este protocolo descreve um método simples para quantificar a precipitação de cálcio mediada por células musculares lisas vasculares in vitro por imagem fluorescente.
Abstract
A calcificação vascular envolve uma série de patologias degenerativas, incluindo inflamação, alterações no fenótipo celular, morte celular e ausência de inibidores da calcificação, que concomitantemente levam a uma perda de elasticidade e função dos vasos. A calcificação vascular é um importante contribuinte para a morbidade e mortalidade em muitas patologias, incluindo doença renal crônica, diabetes mellitus e aterosclerose. Os modelos de pesquisa atuais para estudar a calcificação vascular são limitados e só são viáveis nos estágios finais do desenvolvimento da calcificação in vivo. Ferramentas in vitro para o estudo da calcificação vascular utilizam medições de end-point, aumentando as demandas de material biológico e arriscando a introdução de variabilidade nos estudos de pesquisa. Demonstramos a aplicação de uma nova sonda marcada fluorescentemente que se liga ao desenvolvimento de calcificação in vitro em células musculares lisas vasculares humanas e determina o desenvolvimento em tempo real da calcificação in vitro . Neste protocolo, descrevemos a aplicação de nosso recém-desenvolvido ensaio de calcificação, uma nova ferramenta na modelagem de doenças que tem potenciais aplicações translacionais. Consideramos que este ensaio seja relevante em um espectro mais amplo de pesquisa de deposição mineral, incluindo aplicações em pesquisas ósseas, cartilaginosas ou odontológicas.
Introduction
A calcificação vascular (CV) é um fator de risco independente para morbidade e mortalidade cardiovascular 1,2,3. Há muito considerado um processo químico passivo de deposição mineral ectópica, agora aparece uma resposta de cicatrização tecidual modificável envolvendo a contribuição ativa de várias células, incluindo células musculares lisas vasculares ativadas (hVSMC) como um impulsionador da doença 4,5. In vivo A CV pode ser medida por tomografia computadorizada multislice como avaliação da carga aterosclerótica 6,7,8. Atualmente, uma mudança de paradigma está em andamento, em que a gravidade da CV está se tornando reconhecida como um fator de risco em doenças cardiovasculares, diabetes tipo II, doença renal crônica e envelhecimento 9,10,11,12,13,14,15.
Os hVSMCs são o tipo de célula mais abundante no sistema cardiovascular e um ator principal no desenvolvimento da CV. A calcificação induzida por hVSMC in vitro é um modelo de doença amplamente utilizado para estudar doenças cardiovasculares16,17. No entanto, a maioria dos protocolos para a detecção de calcificação in vitro usa medições de ponto final que podem limitar a aquisição de dados, exigir maior uso de material celular e retardar a pesquisa. Métodos comuns para a detecção da calcificação do hVSMC in vitro incluem o ensaio de o-cresolftaleína, que mede a deposição de cálcio solubilizado em relação à proteína total e requer lise celular18. Além disso, utiliza-se a coloração Alizarin Red, que se liga diretamente aos depósitos de cálcio em células ou tecidos fixos19. Para estudar a calcificação do hVSMC ao longo do tempo com o-cresolftaleína ou Alizarin Red requer lotes de replicações por ponto de tempo, aumentando a demanda por material biológico e, por sua vez, aumentando a chance de variabilidade.
Neste artigo, detalhamos o método para a aplicação de um novo ensaio que utiliza hVSMCs com uma sonda de imagem fluorescente para determinar a progressão da CV in vitro, bem como a função como um ensaio singular de calcificação em estágio terminal. Demonstramos anteriormente que este ensaio é diretamente comparável aos métodos o-cresolftaleína e Alizarina Vermelha e pode ser usado para distinguir entre diferentes condições de cultura20. Além das medidas em tempo real, este ensaio pode ser utilizado para determinar a propensão de amostras de soro ou plasma como um marcador substituto para o desenvolvimento clínico da CV20. Isso ajudará na aplicação de estratégias biológicas das ciências cardiovasculares e modelagem de doenças. Uma aplicação adicional do ensaio pode ser como um sistema BioHybrid translacional para avaliar a gravidade ou a progressão da CV a partir de constituintes sanguíneos, como soro ou plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, descrevemos um método semi-automatizado para determinação da calcificação in vitro . Para este método, três etapas críticas da calcificação do hVSMC devem ser otimizadas. Primeiro, a densidade celular é crítica para o desenvolvimento da calcificação do hVSMC. Baixas densidades de hVSMCs resultarão em calcificação lenta ou nenhuma e morte celular devido à falta de contato célula-a-célula e ao estresse induzido sob condições calcificantes21. Altas den…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelos programas de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o contrato de subvenção Marie Sklodowska-Curie No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Esta pesquisa foi apoiada pela BioSPX. O WJ-D recebeu financiamento do 322900939 de identificação do projeto TRR219 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) e do ID do projeto 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
