طريقة بيولوجية شبه آلية وقابلة للتكرار لتحديد ترسب الكالسيوم في المختبر
Summary
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. يساهم تكلس الأوعية الدموية بشكل كبير في عبء المراضة والوفيات القلبية الوعائية. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لقياس ترسيب الكالسيوم بوساطة خلايا العضلات الملساء الوعائية في المختبر عن طريق التصوير الفلوري.
Abstract
يتضمن تكلس الأوعية الدموية سلسلة من الأمراض التنكسية ، بما في ذلك الالتهاب ، والتغيرات في النمط الظاهري الخلوي ، وموت الخلايا ، وغياب مثبطات التكلس ، والتي تؤدي في نفس الوقت إلى فقدان مرونة الأوعية ووظيفتها. يعد تكلس الأوعية الدموية مساهما مهما في المراضة والوفيات في العديد من الأمراض ، بما في ذلك أمراض الكلى المزمنة والسكري وتصلب الشرايين. نماذج البحث الحالية لدراسة تكلس الأوعية الدموية محدودة ولا يمكن تطبيقها إلا في المراحل المتأخرة من تطور التكلس في الجسم الحي. تستخدم الأدوات المختبرية لدراسة تكلس الأوعية الدموية قياسات نقطة النهاية ، مما يزيد من الطلب على المواد البيولوجية ويخاطر بإدخال التباين في الدراسات البحثية. نوضح تطبيق مسبار جديد يحمل علامة الفلورسنت يرتبط بتطور التكلس في المختبر على خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية ويحدد التطور في الوقت الفعلي للتكلس في المختبر . في هذا البروتوكول ، نصف تطبيق مقايسة التكلس المطورة حديثا ، وهي أداة جديدة في نمذجة الأمراض لها تطبيقات متعدية محتملة. نتصور أن يكون هذا الاختبار ذا صلة بمجموعة أوسع من أبحاث ترسب المعادن ، بما في ذلك التطبيقات في أبحاث العظام أو الغضاريف أو الأسنان.
Introduction
تكلس الأوعية الدموية (VC) هو عامل خطر مستقل لمراضة القلب والأوعية الدموية والوفيات1،2،3. تعتبر منذ فترة طويلة عملية كيميائية سلبية لترسب المعادن خارج الرحم ، ويبدو الآن استجابة قابلة للتعديل لشفاء الأنسجة تنطوي على المساهمة النشطة للخلايا المختلفة بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية المنشطة (hVSMC) كمحرك للمرض 4,5. في الجسم الحي يمكن قياس VC عن طريق التصوير المقطعي المحوسب متعدد الشرائح كتقييم لعبء تصلب الشرايين6،7،8. حاليا ، هناك نقلة نوعية جارية ، حيث أصبحت شدة VC معترف بها كعامل خطر في أمراض القلب والأوعية الدموية ، ومرض السكري من النوع الثاني ، وأمراض الكلى المزمنة ، والشيخوخة9،10،11،12،13،14،15.
hVSMCs هي أكثر أنواع الخلايا وفرة في نظام القلب والأوعية الدموية وفاعل رئيسي في تطوير VC. التكلس الناجم عن hVSMC في المختبر هو نموذج مرض يستخدم على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية16,17. ومع ذلك ، فإن معظم بروتوكولات الكشف عن التكلس في المختبر تستخدم قياسات نقطة النهاية التي يمكن أن تحد من الحصول على البيانات ، وتتطلب استخداما أكبر للمواد الخلوية ، ويمكن أن تبطئ البحث. تشمل الطرق الشائعة للكشف عن تكلس hVSMC في المختبر مقايسة o-cresolphthalein ، والتي تقيس ترسب الكالسيوم المذاب مقابل البروتين الكلي وتتطلب تحلل الخلية18. أيضا ، يتم استخدام تلطيخ Alizarin الأحمر ، والذي يرتبط مباشرة برواسب الكالسيوم على الخلايا الثابتة أو الأنسجة19. لدراسة تكلس hVSMC بمرور الوقت مع o-cresolphthalein أو Alizarin Red يتطلب دفعات من النسخ المتماثلة لكل نقطة زمنية ، مما يزيد من الطلب على المواد البيولوجية ، وبالتالي يزيد من فرصة التباين.
في هذه الورقة ، نقوم بتفصيل طريقة تطبيق مقايسة جديدة تستخدم hVSMCs مع مسبار تصوير فلوري لتحديد تقدم VC في المختبر بالإضافة إلى العمل كاختبار تكلس فريد في المرحلة النهائية. لقد أثبتنا سابقا أن هذا الفحص يمكن مقارنته مباشرة بطريقتي o-cresolphthalein و Alizarin Red ويمكن استخدامه للتمييز بين ظروف الاستزراع المختلفة20. بالإضافة إلى القياسات في الوقت الفعلي ، يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد ميل عينات المصل أو البلازما كعلامة بديلة لتطوير VC السريري20. سيساعد هذا في تطبيق الاستراتيجيات البيولوجية لعلوم القلب والأوعية الدموية ونمذجة الأمراض. قد يكون التطبيق الآخر للمقايسة بمثابة نظام BioHybrid متعدي لتقييم شدة VC أو التقدم من مكونات الدم مثل المصل أو البلازما.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، نصف طريقة شبه آلية لتحديد التكلس في المختبر . لهذه الطريقة ، يجب تحسين ثلاث خطوات حاسمة لتكلس hVSMC. أولا ، الكثافة الخلوية أمر بالغ الأهمية لتطوير تكلس hVSMC. ستؤدي الكثافات المنخفضة ل hVSMCs إلى تكلس بطيء أو معدوم وموت الخلايا بسبب عدم وجود اتصال من خلية إلى خلية والإجهاد ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل برامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابعة للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوفسكا كوري رقم 722609 و 764474 ، NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). تم دعم هذا البحث من قبل BioSPX. تلقت WJ-D تمويلا من Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) TRR219-Project ID 322900939 ومعرف المشروع 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
