Beyin Dilimlerinde Miyelinasyon Görüntüleme için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması
Summary
Miyelinasyonu görselleştirmek, sinir sistemini inceleyen birçok araştırmacı için önemli bir hedeftir. CARS, miyelin gibi özel yapıları aydınlatan beyin gibi doku içindeki lipitleri doğal olarak görüntüleyebilen immünofloresan ile uyumlu bir tekniktir.
Abstract
Tutarlı anti-Stokes Raman spektroskopisi (CARS), kimyagerler ve fizikçiler tarafından moleküllerin imza titreşimlerinin tutarlı bir sinyalini üretmek için klasik olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, bu titreşimsel imzalar aynı zamanda beyin gibi anatomik doku içindeki moleküllerin karakteristiğidir ve bu da onu Sinirbilim uygulamaları için giderek daha kullanışlı ve uygulanabilir hale getirir. Örneğin, CARS, lipitleri, bu moleküller içindeki özellikle heyecan verici kimyasal bağlarla ölçebilir ve nörotransmisyonda yer alan miyelin gibi dokunun farklı yönlerinin nicelleştirilmesine izin verebilir. Ek olarak, tipik olarak miyelini ölçmek için kullanılan diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, CARS ayrıca immünofloresan tekniklerle uyumlu olacak şekilde ayarlanabilir ve sodyum kanalları veya sinaptik iletimin diğer bileşenleri gibi diğer belirteçlerle birlikte etiketlemeye izin verir. Miyelinasyon değişiklikleri, multipl skleroz gibi demiyelinizan hastalıklarda veya Frajil X Sendromu veya otizm spektrum bozuklukları gibi diğer nörolojik durumlarda doğal olarak önemli bir mekanizmadır. Sonuç olarak, CARS, Nörobilimdeki acil soruları cevaplamak ve birçok farklı nörolojik durumla ilgili altta yatan mekanizmalar için kanıt sağlamak için yenilikçi yollarla kullanılabilir.
Introduction
Aksiyon potansiyelleri beyindeki temel bilgi birimidir ve aksonlar aracılığıyla aksiyon potansiyeli yayılımı bilgi işlemenin bir ayağını oluşturur 1,2,3. Nöronlar tipik olarak diğer birçok nörondan afferent girdiler alır ve bu girdileri belirli bir dar zaman aralığı 4,5 içinde bütünleştirir. Bu nedenle, aksonlardaki potansiyel yayılım mekanizmaları araştırmacılardan önemli miktarda ilgi görmüştür.
Bir akson boyunca yayılırken, güvenilir yayılmayı sağlamak için bir aksiyon potansiyeli akson boyunca tekrar tekrar yenilenir6. Çeneli omurgalıların (gnathostomlar) nöronlarının çoğunda, aksonlar, glial hücrelerin tipleri olan yakındaki oligodendrositler veya Schwann hücreleri tarafından üretilen lipit bakımından zengin bir madde olan bir miyelin kılıfı ile çevrilidir (7,8’de gözden geçirilmiştir). Bu miyelin kılıf, aksonu elektriksel olarak yalıtır, kapasitansını azaltır ve aksiyon potansiyelinin verimli, hızlı ve daha düşük enerji tüketimi ile yayılmasına izin verir. Miyelin, aksonu düzgün bir şekilde örtmez, ancak aksonu, Ranvier’in düğümleri olarak adlandırılan aralarında kısa boşluklar olan bölümler halinde kaplar (9,10’da gözden geçirilmiştir). Hem bir aksonun elektriksel yalıtım seviyesini kontrol eden miyelinasyon kalınlığı hem de bir akson boyunca aksiyon potansiyellerinin yenilenme sıklığını kontrol eden Ranvier düğümlerinin aralığı, aksiyon potansiyeli yayılım hızını etkiler (11’de gözden geçirilmiştir).
Miyelinasyon kalınlığının aksonlar12,13,14’teki aksiyon potansiyeli yayılım hızını etkilediğini öne süren geniş bir literatür vardır. Ayrıca, akson miyelinasyonundaki değişiklikler bir dizi CNS açığına neden olabilir 15,16,17,18,19,20,21. Bu nedenle, birçok araştırma çabasının odak noktasının akson miyelinasyonunun ölçümünü ve karakterizasyonunu içermesi şaşırtıcı değildir. Miyelin kalınlığının ölçümleri en yaygın olarak, önemli miktarda doku hazırlığı gerektiren ve immünohistokimya ile kombinasyon halinde kullanılması zor olan bir teknik olan elektron mikroskobu ile yapılmıştır. Bununla birlikte, Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisine (CARS) dayanan akson miyelinasyonunu ölçmek için daha hızlı ve daha basit bir teknik de vardır. Bir CARS lazeri çeşitli frekanslara ayarlanabilir ve lipitleri uyarmak için uygun frekanslara ayarlandığında, miyelin herhangi bir ek etikete ihtiyaç duymadan görüntülenebilir22. Lipid görüntüleme, standart immünohistokimya ile birleştirilebilir, böylece lipitler birkaç floresan kanalı ile birlikte görüntülenebilir23. CARS ile miyelinasyonun görüntülenmesi, elektron mikroskobundan önemli ölçüde daha hızlıdır ve EM’den daha düşük olsa da, aynı tip aksonlardaki miyelinasyondaki küçük farklılıkları bile tespit etmek için yeterli bir çözünürlüğe sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Giderek artan bir literatür, miyelinin beyin fonksiyonlarındaki rolünü vurgulamaktadır 13,16,21,28. Ayrıca, miyelinasyon kalınlığının ve miyelinasyon paterninin multipl skleroz (29’da gözden geçirildi), yaşlanma (30’da gözden geçirildi), otizm 20,31 ve diğerleri gibi çeşitli nörolojik durumlar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) ve NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 ve FRAXA (McCullagh) tarafından desteklenir. CARS görüntüleme, kısmen NIH P30 NS048154 ve NIH P30 DK116073 tarafından desteklenen Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü’ndeki Nöroteknoloji Merkezi’nin Gelişmiş Işık Mikroskobu Çekirdeği bölümünde gerçekleştirildi.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
- Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).
- Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
- Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
- Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
- Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
- Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
- Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
- Saab, A. S., Nave, K. -. A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
- Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
- Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
- Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
- Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
- Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
- Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).
- Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
- Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
- Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
- Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
- Kim, S. -. H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
- . Fluorescence SpectraViewer Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022)
- Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
- Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
- Kútna, V., O’Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
- Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
- Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
- Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).
