Application cohérente de spectroscopie Raman anti-Stokes (CARS) pour l’imagerie de la myélinisation dans les tranches de cerveau
Summary
La visualisation de la myélinisation est un objectif important pour de nombreux chercheurs qui étudient le système nerveux. CARS est une technique compatible avec l’immunofluorescence qui permet d’imager nativement les lipides dans les tissus tels que le cerveau éclairant des structures spécialisées telles que la myéline.
Abstract
La spectroscopie Raman anti-Stokes cohérente (CARS) est une technique classiquement employée par les chimistes et les physiciens pour produire un signal cohérent des vibrations de signature des molécules. Cependant, ces signatures vibratoires sont également caractéristiques des molécules dans le tissu anatomique tels que le cerveau, ce qui les rend de plus en plus utiles et applicables pour les applications en neurosciences. Par exemple, CARS peut mesurer les lipides en activant spécifiquement des liaisons chimiques au sein de ces molécules, ce qui permet de quantifier différents aspects des tissus, tels que la myéline impliquée dans la neurotransmission. En outre, par rapport à d’autres techniques généralement utilisées pour quantifier la myéline, CARS peut également être configuré pour être compatible avec les techniques d’immunofluorescence, permettant le comarquage avec d’autres marqueurs tels que les canaux sodiques ou d’autres composants de la transmission synaptique. Les changements de myélinisation sont un mécanisme intrinsèquement important dans la démyélinisation de maladies telles que la sclérose en plaques ou d’autres affections neurologiques telles que le syndrome de l’X fragile ou les troubles du spectre autistique est un domaine de recherche émergent. En conclusion, CARS peut être utilisé de manière innovante pour répondre à des questions urgentes en neurosciences et fournir des preuves de mécanismes sous-jacents liés à de nombreuses affections neurologiques différentes.
Introduction
Les potentiels d’action sont l’unité de base de l’information dans le cerveau, et la propagation du potentiel d’action à travers les axones constitue un pilier du traitement de l’information 1,2,3. Les neurones reçoivent généralement des entrées afférentes de plusieurs autres neurones et intègrent ces entrées dans une fenêtre temporelle étroitedonnée 4,5. Par conséquent, les mécanismes d’action de propagation potentielle dans les axones ont reçu une attention importante de la part des chercheurs.
Lors de la propagation à travers un axone, un potentiel d’action est régénéré à plusieurs reprises le long de l’axone pour assurer une propagation fiable6. Dans la plupart des neurones des vertébrés à mâchoires (gnathostomes), les axones sont entourés d’une gaine de myéline, qui est une substance riche en lipides produite par les oligodendrocytes voisins ou les cellules de Schwann, qui sont des types de cellules gliales (revue dans 7,8). Cette gaine de myéline isole électriquement l’axone, réduisant sa capacité et permettant une propagation du potentiel d’action efficacement, rapidement et avec une consommation d’énergie réduite. La myéline ne couvre pas l’axone uniformément, mais elle gaine l’axone dans des segments qui ont de courts espaces entre eux, appelés les nœuds de Ranvier (examiné dans 9,10). L’épaisseur de myélinisation, qui contrôle le niveau d’isolation électrique d’un axone, et l’espacement des nœuds de Ranvier, qui contrôlent la fréquence à laquelle les potentiels d’action sont régénérés le long d’un axone, influencent la vitesse de propagation du potentiel d’action (revue en11).
Il existe un grand nombre de littérature suggérant que l’épaisseur de myélinisation affecte la vitesse de propagation du potentiel d’action dans les axones12,13,14. De plus, les altérations de la myélinisation axonale peuvent entraîner un certain nombre de déficits du SNC 15,16,17,18,19,20,21. Il n’est donc pas surprenant que de nombreux efforts de recherche portent sur la mesure et la caractérisation de la myélinisation axonale. Les mesures de l’épaisseur de la myéline ont le plus souvent été effectuées par microscopie électronique, une technique qui nécessite une quantité importante de préparation tissulaire et qui est difficile à utiliser en combinaison avec l’immunohistochimie. Cependant, il existe également une technique plus rapide et plus simple pour mesurer la myélinisation axonale qui est basée sur la spectroscopie Raman anti-Stokes cohérente (CARS). Un laser CARS peut être réglé sur différentes fréquences et lorsqu’il est accordé à des fréquences adaptées à l’excitation des lipides, la myéline peut être imagée sans avoir besoin d’étiquettes supplémentaires22. L’imagerie lipidique peut être combinée avec l’immunohistochimie standard de sorte que les lipides peuvent être imagés avec plusieurs canaux fluorescents23. L’imagerie de la myélinisation avec CARS est significativement plus rapide que la microscopie électronique et a une résolution qui, bien que inférieure à EM, est suffisante pour détecter même de petites différences de myélinisation dans le même type d’axones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un nombre croissant de littérature souligne le rôle de la myéline dans le fonctionnement du cerveau 13,16,21,28. De plus, nous savons que l’épaisseur et le modèle de myélinisation peuvent changer dans plusieurs affections neurologiques telles que la sclérose en plaques (examinée dans29), le vieillissement (revue dans 30), l’autisme20<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pris en charge par NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) et NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 et FRAXA (McCullagh). L’imagerie CARS a été réalisée dans la partie centrale de microscopie optique avancée du Centre de neurotechnologie du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado, soutenue en partie par NIH P30 NS048154 et NIH P30 DK116073.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
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