Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices
Summary
Het visualiseren van myelinisatie is een belangrijk doel voor veel onderzoekers die het zenuwstelsel bestuderen. CARS is een techniek die compatibel is met immunofluorescentie die lipiden in weefsel zoals de hersenen die gespecialiseerde structuren zoals myeline verlichten, native in beeld kan brengen.
Abstract
Coherente anti-Stokes Raman spectroscopie (CARS) is een techniek die klassiek wordt gebruikt door chemici en natuurkundigen om een coherent signaal van kenmerkende trillingen van moleculen te produceren. Deze vibrationele handtekeningen zijn echter ook kenmerkend voor moleculen in anatomisch weefsel zoals de hersenen, waardoor het steeds nuttiger en toepasbaarder wordt voor neurowetenschappelijke toepassingen. CARS kan bijvoorbeeld lipiden meten door specifiek opwindende chemische bindingen binnen deze moleculen, waardoor verschillende aspecten van weefsel kunnen worden gekwantificeerd, zoals myeline die betrokken is bij neurotransmissie. Bovendien kan CARS, in vergelijking met andere technieken die doorgaans worden gebruikt om myeline te kwantificeren, ook worden ingesteld om compatibel te zijn met immunofluorescentietechnieken, waardoor co-labeling met andere markers zoals natriumkanalen of andere componenten van synaptische transmissie mogelijk is. Myelinisatieveranderingen zijn een inherent belangrijk mechanisme bij het demyeliniseren van ziekten zoals multiple sclerose of andere neurologische aandoeningen zoals het Fragiele X-syndroom of autismespectrumstoornissen is een opkomend onderzoeksgebied. Kortom, CARS kan op innovatieve manieren worden gebruikt om prangende vragen in de neurowetenschappen te beantwoorden en bewijs te leveren voor onderliggende mechanismen die verband houden met veel verschillende neurologische aandoeningen.
Introduction
Actiepotentialen zijn de basiseenheid van informatie in de hersenen en actiepotentiale voortplanting door axonen vormt een pijler van informatieverwerking 1,2,3. Neuronen ontvangen meestal afferente inputs van meerdere andere neuronen en integreren deze inputs binnen een bepaald smal tijdvenster 4,5. Daarom hebben de mechanismen van actiepotentiaalvoortplanting in axonen een aanzienlijke hoeveelheid aandacht gekregen van onderzoekers.
Bij vermeerdering door een axon wordt een actiepotentiaal herhaaldelijk langs het axon geregenereerd om een betrouwbare voortplanting te garanderen6. In de meeste neuronen van kaakgewervelde dieren (gnathostomen) zijn axonen omgeven door een omhulsel van myeline, een lipiderijke stof die wordt geproduceerd door nabijgelegen oligodendrocyten of Schwann-cellen, die soorten gliacellen zijn (besproken in 7,8). Deze myelineschede isoleert het axon elektrisch, vermindert de capaciteit en maakt een efficiënte, snelle en met een lager energieverbruik mogelijk. Myeline bedekt het axon niet uniform, maar het omhult het axon in segmenten met korte openingen ertussen, de knooppunten van Ranvier genoemd (besproken in 9,10). Zowel de myelinisatiedikte, die het niveau van elektrische isolatie van een axon regelt, als de afstand van de knooppunten van Ranvier, die de frequentie regelen waarmee actiepotentialen langs een axon worden geregenereerd, beïnvloeden de snelheid van de voortplanting van actiepotentialen (besproken in11).
Er is een grote hoeveelheid literatuur die suggereert dat de dikte van de myelinisatie de snelheid van actiepotentiaalvoortplanting in axonen beïnvloedt 12,13,14. Bovendien kunnen veranderingen in axonmyelinisatie resulteren in een aantal CZS-tekorten 15,16,17,18,19,20,21. Het is daarom niet verwonderlijk dat de focus van veel onderzoeksinspanningen ligt op het meten en karakteriseren van axonmyelinisatie. Metingen van myelinedikte zijn meestal gedaan met elektronenmicroscopie, een techniek die een aanzienlijke hoeveelheid weefselvoorbereiding vereist en een uitdaging is om te gebruiken in combinatie met immunohistochemie. Er is echter ook een snellere en eenvoudigere techniek om axonmyelinisatie te meten die is gebaseerd op Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). Een CARS-laser kan worden afgestemd op verschillende frequenties en wanneer afgestemd op frequenties die geschikt zijn om lipiden te exciteren, kan myeline worden afgebeeld zonder dat er extra labels nodig zijn22. De lipide beeldvorming kan worden gecombineerd met standaard immunohistochemie, zodat lipiden samen met verschillende fluorescerende kanalen kunnen worden afgebeeld23. Beeldvorming van myelinisatie met CARS is aanzienlijk sneller dan elektronenmicroscopie en heeft een resolutie die, zij het lager dan EM, voldoende is om zelfs kleine verschillen in myelinisatie in hetzelfde type axonen te detecteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een groeiende hoeveelheid literatuur benadrukt de rol van myeline in de hersenfunctie 13,16,21,28. Bovendien weten we dat myelinisatiedikte en myelinisatiepatroon kunnen veranderen in verschillende neurologische aandoeningen zoals multiple sclerose (beoordeeld in29), veroudering (beoordeeld in30), autisme20,31<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) en NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 en FRAXA (McCullagh). De CARS-beeldvorming werd uitgevoerd in het Advanced Light Microscopy Core-deel van het NeuroTechnology Center aan de University of Colorado Anschutz Medical Campus, gedeeltelijk ondersteund door NIH P30 NS048154 en NIH P30 DK116073.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
- Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).
- Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
- Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
- Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
- Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
- Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
- Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
- Saab, A. S., Nave, K. -. A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
- Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
- Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
- Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
- Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
- Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
- Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).
- Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
- Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
- Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
- Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
- Kim, S. -. H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
- . Fluorescence SpectraViewer Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022)
- Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
- Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
- Kútna, V., O’Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
- Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
- Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
- Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).
