تطبيق التحليل الطيفي رامان المتماسك المضاد لستوكس (CARS) لتصوير الميالين في شرائح الدماغ
Summary
يعد تصور الميالين هدفا مهما للعديد من الباحثين الذين يدرسون الجهاز العصبي. CARS هي تقنية متوافقة مع التألق المناعي الذي يمكنه تصوير الدهون داخل الأنسجة مثل الدماغ الذي يضيء الهياكل المتخصصة مثل المايلين.
Abstract
التحليل الطيفي المتماسك المضاد لستوكس رامان (CARS) هو تقنية يستخدمها الكيميائيون والفيزيائيون بشكل كلاسيكي لإنتاج إشارة متماسكة من الاهتزازات المميزة للجزيئات. ومع ذلك ، فإن هذه التوقيعات الاهتزازية هي أيضا سمة مميزة للجزيئات داخل الأنسجة التشريحية مثل الدماغ ، مما يجعلها مفيدة بشكل متزايد وقابلة للتطبيق على تطبيقات علم الأعصاب. على سبيل المثال ، يمكن ل CARS قياس الدهون عن طريق الروابط الكيميائية المثيرة على وجه التحديد داخل هذه الجزيئات ، مما يسمح بتحديد الجوانب المختلفة للأنسجة ، مثل المايلين المشارك في النقل العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع التقنيات الأخرى المستخدمة عادة لتحديد كمية المايلين ، يمكن أيضا إعداد CARS لتكون متوافقة مع تقنيات الفلورسنت المناعي ، مما يسمح بوضع العلامات المشتركة مع علامات أخرى مثل قنوات الصوديوم أو المكونات الأخرى للانتقال المشبكي. تغيرات الميالين هي آلية مهمة بطبيعتها في إزالة الميالين من الأمراض مثل التصلب المتعدد أو الحالات العصبية الأخرى مثل متلازمة X الهشة أو اضطرابات طيف التوحد هي مجال ناشئ من مجالات البحث. في الختام ، يمكن استخدام CARS بطرق مبتكرة للإجابة على الأسئلة الملحة في علم الأعصاب وتقديم أدلة على الآليات الأساسية المتعلقة بالعديد من الحالات العصبية المختلفة.
Introduction
إمكانات العمل هي الوحدة الأساسية للمعلومات في الدماغ ، ويشكل الانتشار المحتمل للعمل من خلال المحاور العصبية أحد أعمدة معالجة المعلومات1،2،3. تتلقى الخلايا العصبية عادة مدخلات قريبة من خلايا عصبية أخرى متعددة وتدمج هذه المدخلات ضمن نافذة زمنية ضيقة معينة 4,5. لذلك ، تلقت آليات الانتشار المحتمل للعمل في المحاور العصبية قدرا كبيرا من الاهتمام من المحققين.
عند الانتشار من خلال محور عصبي ، يتم تجديد إمكانات العمل بشكل متكرر على طول المحور العصبي لضمان انتشار موثوق به6. في معظم الخلايا العصبية للفقاريات ذات الفكين (gnathostomes) ، تحيط المحاور العصبية بغمد من المايلين ، وهي مادة غنية بالدهون تنتجها الخلايا قليلة التغصن القريبة أو خلايا شوان ، وهي أنواع من الخلايا الدبقية (تمت مراجعتها في 7,8). يعزل غمد المايلين هذا المحور العصبي كهربائيا ، مما يقلل من سعته ويسمح بالانتشار المحتمل للعمل بكفاءة وسرعة واستهلاك أقل للطاقة. لا يغطي المايلين المحور العصبي بشكل موحد ، ولكنه يغمد المحور العصبي في أجزاء تحتوي على فجوات قصيرة بينهما ، تسمى عقد رانفييه (تمت مراجعتها في 9,10). يؤثر كل من سمك الميالين ، الذي يتحكم في مستوى العزل الكهربائي للمحور العصبي ، وتباعد عقد رانفييه ، التي تتحكم في التردد الذي يتم به تجديد إمكانات الفعل على طول محور عصبي ، على سرعة انتشار إمكانات العمل (تمت مراجعته في11).
هناك مجموعة كبيرة من الأدبيات التي تشير إلى أن سمك الميالين يؤثر على سرعة الانتشار المحتمل للعمل في المحاورالعصبية 12،13،14. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي التغييرات في الميالين المحوري إلى عدد من عجز CNS 15,16,17,18,19,20,21. لذلك ليس من المستغرب أن تركيز العديد من الجهود البحثية ينطوي على قياس وتوصيف الميالين المحوري. تم إجراء قياسات سمك المايلين بشكل شائع باستخدام المجهر الإلكتروني ، وهي تقنية تتطلب قدرا كبيرا من إعداد الأنسجة ويصعب استخدامها مع الكيمياء النسيجية المناعية. ومع ذلك ، هناك أيضا تقنية أسرع وأبسط لقياس الميالين المحوري الذي يعتمد على التحليل الطيفي المضاد لستوكس (CARS). يمكن ضبط ليزر CARS على ترددات مختلفة وعند ضبطه على ترددات مناسبة لإثارة الدهون ، يمكن تصوير المايلين دون الحاجة إلى أي ملصقات إضافية22. يمكن دمج تصوير الدهون مع الكيمياء النسيجية المناعية القياسية بحيث يمكن تصوير الدهون مع العديد من قنوات الفلورسنت23. التصوير الميالين باستخدام CARS أسرع بكثير من المجهر الإلكتروني وله دقة ، وإن كانت أقل من EM ، كافية للكشف عن الاختلافات الصغيرة في الميالين في نفس النوع من المحاور العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تؤكد مجموعة متزايدة من الأدبيات على دور المايلين في وظائف الدماغ13،16،21،28. علاوة على ذلك ، نحن نعلم أن سمك الميالين ونمط الميالين يمكن أن يتغير في العديد من الحالات العصبية مثل التصلب المتعدد (تمت مراجعته في29</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من NIH R01 DC 17924 و R01 DC 18401 (Klug) و NIH 1R15HD105231-01 و T32DC012280 و FRAXA (McCullagh). تم إجراء تصوير CARS في الجزء الأساسي من المجهر الضوئي المتقدم من مركز NeuroTechnology في الحرم الجامعي الطبي بجامعة كولورادو Anschutz المدعوم جزئيا من NIH P30 NS048154 و NIH P30 DK116073.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
- Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).
- Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
- Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
- Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
- Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
- Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
- Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
- Saab, A. S., Nave, K. -. A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
- Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
- Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
- Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
- Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
- Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
- Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).
- Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
- Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
- Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
- Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
- Kim, S. -. H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
- . Fluorescence SpectraViewer Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022)
- Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
- Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
- Kútna, V., O’Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
- Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
- Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
- Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).
