Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

I potenziali d’azione sono l’unità di base dell’informazione nel cervello e la propagazione del potenziale d’azione attraverso gli assoni costituisce un pilastro dell’elaborazione delle informazioni ^1,2,3. I neuroni ricevono tipicamente input afferenti da più altri neuroni e integrano questi input all’interno di una data finestra temporale ristretta ^4,5. Pertanto, i meccanismi di propagazione del potenziale d’azione negli assoni hanno ricevuto una notevole attenzione da parte degli investigatori.

Quando si propaga attraverso un assone, un potenziale d’azione viene rigenerato ripetutamente lungo l’assone per garantire una propagazione affidabile⁶. Nella maggior parte dei neuroni dei vertebrati mascellari (gnatostomi) gli assoni sono circondati da una guaina di mielina, che è una sostanza ricca di lipidi prodotta dagli oligodendrociti vicini o dalle cellule di Schwann, che sono tipi di cellule gliali (rivisto in ^7,8). Questa guaina mielinica isola elettricamente l’assone, riducendone la capacità e consentendo la propagazione del potenziale d’azione in modo efficiente, rapido e con un minor consumo di energia. La mielina non copre l’assone in modo uniforme, ma riveste l’assone in segmenti che hanno brevi spazi tra di loro, chiamati nodi di Ranvier (recensito in ^9,10). Sia lo spessore della mielinizzazione, che controlla il livello di isolamento elettrico di un assone, sia la spaziatura dei nodi di Ranvier, che controllano la frequenza con cui i potenziali d’azione vengono rigenerati lungo un assone, influenzano la velocità di propagazione del potenziale d’azione (rivisto in¹¹).

C’è un ampio corpo di letteratura che suggerisce che lo spessore della mielinizzazione influenza la velocità di propagazione del potenziale d’azione negli assoni^12,13,14. Inoltre, alterazioni nella mielinizzazione degli assoni possono provocare un numero di deficit del SNC 15,16,17,18,19,20,21. Non sorprende quindi che il focus di molti sforzi di ricerca riguardi la misurazione e la caratterizzazione della mielinizzazione assonica. Le misurazioni dello spessore della mielina sono state comunemente eseguite con la microscopia elettronica, una tecnica che richiede una quantità significativa di preparazione dei tessuti ed è difficile da usare in combinazione con l’immunoistochimica. Tuttavia, esiste anche una tecnica più rapida e semplice per misurare la mielinizzazione degli assoni basata sulla spettroscopia Raman coerente anti-Stokes (CARS). Un laser CARS può essere sintonizzato su varie frequenze e quando sintonizzato su frequenze adatte ad eccitare i lipidi, la mielina può essere ripresa senza la necessità di etichette aggiuntive²². L’imaging lipidico può essere combinato con l’immunoistochimica standard in modo tale che i lipidi possano essere visualizzati insieme a diversi canali fluorescenti²³. La mielinizzazione per immagini con CARS è significativamente più veloce della microscopia elettronica e ha una risoluzione che, sebbene inferiore a EM, è sufficiente per rilevare anche piccole differenze nella mielinizzazione nello stesso tipo di assoni.