Su Kaynaklı Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması ve Antibiyotik Direnç Genlerinin Moleküler Karakterizasyonu
Summary
Burada, antibiyotiğe dirençli bakterilerin sudan izolasyonu ve tanımlanması ve antibiyotik direnç genlerinin (ARG’ler) moleküler karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kültür temelli ve kültüre dayalı olmayan (metagenomik analiz) tekniklerin kullanımı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan’dan tatlı sularda bulunan farklı ARG’lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi sağlar.
Abstract
Tatlı su kütleleri ile ilişkili mikrobiyota yoluyla antibiyotik direncinin (AR) gelişimi ve yayılması önemli bir küresel sağlık sorunudur. Bu çalışmada, tatlı su örnekleri, hem geleneksel kültür temelli teknikler hem de yüksek verimli kültürden bağımsız metagenomik bir yaklaşım kullanılarak toplam bakteri çeşitliliği ve AR genleri (ARG’ler) açısından toplandı ve analiz edildi. Bu yazıda, tatlı su örneklerinden elde edilen toplam ve antibiyotiğe dirençli kültürlenebilir bakterilerin sayımı ve kültürlenebilir izolatlarda fenotipik ve genotipik direncin belirlenmesi için sistematik bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, tatlı su örneğinden ekstrakte edilen toplam metagenomik DNA’nın tüm metagenomik analizinin, kültürlenemeyen bakteriler de dahil olmak üzere genel bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve su kütlesindeki toplam farklı ARG (rezistans)” havuzunun tanımlanması için kullanıldığını bildiriyoruz. Bu ayrıntılı protokolleri takiben, 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL aralığında yüksek antibiyotiğe dirençli bakteri yükü gözlemledik. Çoğu izolat, sefotaksim, ampisilin, levofloksasin, kloramfenikol, seftriakson, gentamisin, neomisin, trimetoprim ve siprofloksasin dahil olmak üzere çoklu test edilen antibiyotiklere dirençliydi ve çoklu antibiyotik direnci (MAR) indeksleri ≥0.2 idi ve izolatlarda yüksek direnç seviyelerini gösterdi. 16S rRNA dizilimi, Klebsiella pneumoniae gibi potansiyel insan patojenlerini ve Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. ve Aeromonas spp. gibi fırsatçı bakterileri tanımladı. İzolatların moleküler karakterizasyonu, blaTEM, blaCTX-M (β-laktamlar), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglikozitler) ve dfr1 (trimetoprimler) gibi çeşitli ARG’lerin varlığını gösterdi ve bu da tüm metagenomik DNA analizi ile doğrulandı. Metagenomik DNA’da antibiyotik efflux pompaları –mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamaz-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, kloramfenikol asetiltransferaz geni catB10 ve rifampisin direnç geni rphB- için kodlayan diğer ARG’lerin yüksek prevalansı da tespit edilmiştir. Bu çalışmada tartışılan protokollerin yardımıyla, çeşitli AR fenotipik ve genotipik özelliklere sahip su kaynaklı MAR bakterilerinin varlığını doğruladık. Bu nedenle, tüm metagenomik DNA analizi, bir su kütlesinin genel AR durumunu belirlemek için geleneksel kültür tabanlı tekniklere tamamlayıcı bir teknik olarak kullanılabilir.
Introduction
Antimikrobiyal direnç (AMR) en acil küresel sorunlardan biri olarak tanımlanmıştır. AMR’nin hızlı evrimi ve dünya çapında yayılması, bununla ilişkili sağlık maliyetleri açısından insan sağlığına ve küresel ekonomiye yönelik en büyük tehditlerden biridir1. Antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı AR’de artışa neden olmuştur. Bu, COVID-19 pandemisi tarafından vurgulanmıştır; bu süre zarfında, birçok durumda, etkilenen hastalarda AMR nedeniyle ilişkili ikincil enfeksiyonların tedavisi büyük ölçüde tehlikeye girmiştir2. Antibiyotiklerin insanlar tarafından doğrudan kullanımı/yanlış kullanımının yanı sıra, tarım ve hayvancılıkta antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı ve su kütleleri de dahil olmak üzere çevreye uygunsuz şekilde deşarj edilmesi büyük bir endişe kaynağıdır3. Bakterilerde yeni direnç özelliklerinin ve çoklu ilaç direncinin artması, AR’nin gelişmesine ve yayılmasına yol açan faktörlerin daha iyi anlaşılması ihtiyacını acilen vurgulamaktadır. Plazmidler gibi mobil genetik elementler üzerinde sıklıkla çoklu AR genleri (ARG’ler) taşıyan çoklu antibiyotiğe dirençli bakteriler, bu direnç genlerini potansiyel insan patojenleri de dahil olmak üzere dirençli olmayan mikroorganizmalara aktarabilir ve böylece son çare antibiyotiklerle bile tedavi edilemeyen süper böceklerin ortaya çıkmasına neden olabilir4. Bu çoklu antibiyotiğe dirençli bakteriler, eğer su ekosistemlerinde mevcutsa, balık, yengeç ve yumuşakçalar gibi kontamine su bazlı gıdaların tüketimi yoluyla doğrudan insan bağırsağına girebilir. Önceki çalışmalar, AR bakterilerinin doğal olarak oluşan su sistemlerinde yayılmasının, içme suyu da dahil olmak üzere diğer su kaynaklarına da ulaşabileceğini ve böylece insan besin zincirine girebileceğini göstermiştir 5,6,7.
Bu çalışmanın amacı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan’daki bir su kütlesinde bulunan farklı ARG’lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi edinmek için kültür tabanlı ve kültür tabanlı olmayan (tüm metagenomik analiz) tekniklerin bir kombinasyonunu kullanarak kapsamlı bir protokol sağlamaktır. Geleneksel olarak, su kütlelerindeki bakteri çeşitliliğini incelemek için kültür temelli teknikler kullanılmıştır. Kültürlenebilir mikroorganizmalar, herhangi bir niş içindeki toplam mikrobiyotanın sadece küçük bir yüzdesini oluşturduğundan, bakteri çeşitliliğinin genel durumunu ve herhangi bir numunede yaygın olan çeşitli dirençli özellikleri daha iyi anlamak için, çeşitli kültür bazlı ve kültürden bağımsız teknikler birlikte kullanılmalıdır. Böyle sağlam ve güvenilir bir kültürden bağımsız teknik, tüm metagenomik DNA analizidir. Bu yüksek verimli yöntem, bakteri çeşitliliği veya çeşitliARG’lerin fonksiyonel ek açıklamaları 8,9 ile ilgili çeşitli çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik, metagenomu (bir numunedeki toplam genetik materyal) çeşitli analizler için başlangıç materyali olarak kullanır ve bu nedenle kültürden bağımsızdır. Bu çalışmadaki protokoller, su örneklerinde toplam bakteri çeşitliliği ve çeşitli ARG’ler (rezistom) hakkında bilgi edinmek için tüm metagenomik DNA analizi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Örneklem toplama ve işleme önemli bir rol oynar ve çalışmanın sonuçlarını ve yorumlanmasını etkileyebilir. Bu nedenle, numunelerdeki değişkenliği dışlamak için, incelenen tatlı su kütlesinin birden fazla yerinde örnekleme yapmak önemlidir. Bu tür numuneleri işlerken uygun aseptik çevre koşullarının korunması, kontaminasyonu önleyebilir. Ayrıca, ekstrakte edilen nükleik asitlerin kalitesini ve miktarını etkileyebilecek bakteri bileşimindeki değişiklikleri önlemek için, transit koşul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Mumbai Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Bölümü-Üniversite Araştırma ve Bilimsel Mükemmellik Teşvik (DST-PURSE) Programından mali hibelerle desteklenmiştir. Devika Ghadigaonkar, program kapsamında Proje Üyesi olarak çalıştı. Bilim ve Teknoloji Bölümü-Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (DST-SERB) Proje no: CRG/2018/003624 kapsamında Kıdemli Araştırma Görevlisi Harshali Shinde tarafından sağlanan teknik yardım kabul edilmektedir.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
